血清清蛋白與血漿γ-球蛋白的分離定量純化和鑒定

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1、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)班級(jí)：11級(jí)口腔木科2班姓名：段康博陳曉紅章瑞雪郭昌再高原段康博學(xué)號(hào)：201150166201150167201150163201150145201150143【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?.了解并基本掌握蛋白質(zhì)分離提純的過(guò)程2.從血清中分離并純化血清清蛋白和y■球蛋白。3.進(jìn)行血清清蛋白和丫■球蛋白的定量和鑒定4.4.掌握電泳的原理方法及應(yīng)用【實(shí)驗(yàn)原理】血漿蛋白是血漿中最主要的固體成分，血漿蛋白質(zhì)種類(lèi)繁多，功能各異。川不同的分離方法可將血漿蛋白質(zhì)分為不同的種類(lèi)。在生物化學(xué)研究中，山于它們所帶電荷不同、和

2、刈分子質(zhì)量不同，在高濃度鹽溶液中的溶解度不同，因此可利用它們?cè)谥行喳}溶液中溶解度的差異而進(jìn)行沉淀分離，用鹽析法將血漿蛋白分為白蛋白（即清蛋白）、球蛋白與纖維蛋白原三大類(lèi)。川鹽析法分離而得的蛋白質(zhì)含冇大量的硫酸鞍，會(huì)妨礙蛋白質(zhì)的進(jìn)一步純化，因此必須去除，常用的侑透析法、凝膠過(guò)濾法等。木實(shí)驗(yàn)采用凝膠過(guò)濾法。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液再經(jīng)DEAE纖維素層析柱進(jìn)一步純化。DEAE纖維素為陰離子交換劑，在pH6.5的條件下帶冇正電荷，能吸附帶負(fù)電荷的a-球蛋白和卜球蛋白（pl分別為4.9、5.06和5.12）,而匕

3、球蛋白（pl7.3）在此條件下帶正電荷，不被吸附故直接從層析柱流出，此時(shí)收集的流出液即為純化的L球蛋口。提高醋酸鍍?nèi)芤旱臐舛鹊?.06mol/L,DEAE纖維索層析柱上的球蛋口及部分a?球蛋白可被洗脫下來(lái)。將酷酸鞍溶液的濃度提高至0.3mol/L,則清蛋口被洗脫下來(lái),此時(shí)收集的流出液即為較純的清蛋白。經(jīng)DEAE纖維素陰離子交換柱純化的清蛋白、丫一球蛋白液往往體積較大，樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。為便于鑒定，常需濃縮。濃縮的方法很多，本實(shí)驗(yàn)選用聚乙二醇透析濃縮的方法。血清清蛋口、嚴(yán)球蛋口分離純化后，選用醋酸纖

4、維薄膜電泳法鑒定其純度。然后，用酷酸纖維素薄膜電泳可分為五個(gè)區(qū)帶，Y?球蛋白的等電點(diǎn)為7.3,在pH&6的巴比妥緩沖液中，帶的負(fù)電荷最少，因此在電場(chǎng)中比其它蛋白質(zhì)移動(dòng)速度慢。而清蛋白等其它蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)均小于7.3（pl分別為4.9、5.06和5.12）,因此在電場(chǎng)中比冶球蛋白移動(dòng)速度快。2s（此處插圖）飽和度的硫酸狡溶液沉淀的球狀蛋白質(zhì)。血清白蛋白在血液中冇重要生理功能，和維持血液正常滲透壓冇關(guān)，是血液總滲透壓的主要調(diào)節(jié)物質(zhì)。血清口蛋口的另一作用是作為脂肪酸的載體參與運(yùn)送脂肪酸。Y-球蛋口乂稱(chēng)免

5、疫球蛋口，在血清蛋口質(zhì)小數(shù)量居第三，具有重要的i用價(jià)值。【實(shí)驗(yàn)試劑與器材】試劑：(1)飽和硫酸鞍溶液：稱(chēng)取固體硫酸鞍850g加入lOOOmL蒸懾水中，在70-80°CH攪拌促熔，室溫中放置過(guò)後，瓶底析出白色結(jié)品，上清液即為飽和硫酸鍍液。(2)0.3mol/LpH6.5酷酸鞍緩沖液：稱(chēng)収酷酸鞍23.12g,加蒸謂水800mL,用稀氨水或稀醋酸調(diào)pH至6.5,定容至lOOOmLo(不得加熱)(3)0.06mol/LpH6.5醋酸鞍緩沖液：取上液川蒸憎水稀釋5倍。(4)0.02mol/LpH6.5醋酸錢(qián)

6、緩沖液：取上液川蒸僻水稀釋3倍。(5)巴比妥緩沖液(pH8.6,離子強(qiáng)度0.06)：稱(chēng)取巴比妥納12.76g,巴比妥1.66g,蒸鐳水溶解并定容至1000mLo(6)染色液：氨基黑10B0.25g,用甲醇5()mL、冰醋酸10mL、水40mL溶解。(7)漂洗液：甲醇或乙醇45niL,冰醋酸5mL,水50mL,混勻。(8)DEAE纖維素(9)新鮮血清(10)聚乙二醇(11)葡聚糖凝膠G?25(12)300g/L三氯乙酸器材：(13)納氏試劑離心機(jī)和刻度離心管電泳儀電泳槽醋酸纖維膜pH試紙抽濾瓶黑、片

7、反丿應(yīng)板透析袋鐵架臺(tái)濾紙點(diǎn)樣器層析柱(1.5x20cm)吸量管銀子微量加樣器布氏漏斗培養(yǎng)皿【實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備】DEAE纖維素處理：最取DEAE-纖維素20mL,加O.5mol/LHC1溶液50mL,攪拌后放置20min,川布氏漏斗抽干去除上清液，再用蒸鐳水反復(fù)洗數(shù)次直至pH4.0為止。加等體積0.5mol/LNaOH溶液，攪拌后放置20min,虹吸去除上清液，同上用蒸鐳水反復(fù)洗至pH<7為止。然后轉(zhuǎn)移到燒杯內(nèi)，加0.02mol/LpH6.5醋酸錢(qián)緩沖液40mL放置30min。待裝柱?！緦?shí)驗(yàn)步驟】分離和純化

8、1?取刻度離心錚1支，加入l.OmL新鮮血清，邊搖邊緩慢滴入飽和硫酸錢(qián)液l.OmLo混勻后室溫下放置10min,4000r/min離心10mino用滴管小心吸出上清液置于試管中，即為粗清蛋白液。2.離心管底部的沉淀加入0.8mL蒸飾水，振蕩溶解，即為粗球蛋口液。3.凝膠的處理：量取30mL葡聚糖凝膠G-25G,加入2倍量的().02mol/LpH6.5醋酸錢(qián)緩沖液，置于沸水浴中l(wèi)ho取出冷卻，待凝膠下沉后，傾去含冇細(xì)微懸浮物的上層液。4.裝柱平衡：選用1.5x20cm層析柱，垂直夾