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《血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、純化與鑒定實驗報告》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、南方醫(yī)科女修生物化學(xué)實驗報告姓名:學(xué)號:專業(yè)年級:組另IJ:生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心南方醫(yī)科女修生物化學(xué)實驗報告姓名:學(xué)號:專業(yè)年級:組另IJ:生物化學(xué)與分子生物學(xué)實驗教學(xué)中心實驗名稱血清清蛋白、Y■球蛋白的分離、純化與鑒定實驗日期實驗地點合作者指導(dǎo)老師評分XX教師簽名李某某批改日期2013-06-03Roman；標(biāo)題用:no四號，黑體，加粗。需強調(diào)的地方請用藍(lán)顏色標(biāo)出。不得出格式要求：正文請統(tǒng)一用：小四號，宋體，1.5倍行距；數(shù)字.英文用TimesNew現(xiàn)多行、多頁空白現(xiàn)象?！?、實驗?zāi)康?、掌握鹽析法、凝膠層析法、離子交換層析法分離蛋口質(zhì)的原
2、理和基本方法。2、掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法。3、了解柱層析技術(shù)。二、實驗原理1、粗提（鹽析法）：蛋口質(zhì)分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因為有兩個穩(wěn)定因素：表面的電荷和水化膜。當(dāng)維持蛋口質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時，蛋白質(zhì)分子可相互聚集沉淀而析出。鹽在水溶液中電離所形成的正負(fù)離子可吸引水分子，從而奪取蛋白質(zhì)分子上的水化膜，還可中和部分電荷使蛋口質(zhì)分子聚集而沉淀，從而達(dá)到鹽析沉淀蛋白質(zhì)的目的。由于血清中各種蛋口質(zhì)顆粒大小、所帶電荷多少及親水程度不同，因此，利用不同濃度的硫酸錢溶液分段鹽析,便可將血清中清蛋口和球蛋口從溶液中沉淀岀來，達(dá)到初步分離清蛋白、球蛋
3、口的目的。2、脫鹽（凝膠層析法）凝膠層析法利用蛋口質(zhì)與無機鹽類之間分子量的差異。當(dāng)溶液通過凝膠柱時，溶液中分子量較大的蛋口質(zhì)因為不能通過網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠顆粒，沿著凝膠顆粒間的間隙流動,所以流程較短，向前移動速度較快，最先流出層析柱。而鹽的分子量較小，可通過網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠顆粒，所以流程長，向前移動速度較慢，較晚流出層析柱。從而可達(dá)到去鹽的目的。3、純化（離子交換層析法）離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進(jìn)行可逆的的交換過程。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負(fù)電荷的交換劑稱為陽離子交換劑。本實驗采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，溶液中帶負(fù)電荷的離子
4、可與其進(jìn)行交換結(jié)合，帶正電荷的離子則不能，這樣便可達(dá)到分離純化的目的。脫鹽后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白，利用它們的等電點的不同可進(jìn)行分離。血清中各種蛋白質(zhì)的pl各不相同，因此，在同一醋酸鍍緩沖液中，各蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，可以通過DEAE離子交換層析將血清清蛋白和丫■球蛋白分離出來。4、純度鑒定（電泳）采用醋酸纖維素薄膜電泳對分離得到的清蛋白和Y■球蛋白進(jìn)行純度鑒定，以正常血清樣品作對照。比較兩者電泳圖譜可定性判斷純化的清蛋白和Y■球蛋白的純度。三、材料與方法：以流程圖示意材料：1、樣品：健康人血清（新鮮、無溶血、無沉淀物或細(xì)菌滋生）2、試劑：O.3
5、mol/L的PH6.5醋酸鍍緩沖液、0.06mol/L的PH6.5醋酸鞍緩沖液＞0.02mol/L的PH6.5醋酸鞍緩沖液、1.5mol/L的NaCl-0.3mol/NH4Ac溶液、飽和硫酸鍍?nèi)芤骸?.92mol/L（20%）磺基水楊酸、0.05mol/L（1%）BaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥緩沖液、漂洗液。3、儀器及器材：層析柱、燒杯、移液槍、加樣槍、試管、濾紙、醋酸纖維素薄膜、黑色反應(yīng)板、鐵固定架、螺旋夾、離心管和離心機、培養(yǎng)皿、載玻片、濾紙、平頭銀子、電泳槽、直流穩(wěn)壓電泳儀。方法:粗提脫鹽—>（鹽析法）（凝膠層析法）純化純度鑒定—>取血清0
6、.8ml,邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸錢溶液0.8ml,混勻室溫放置lOmin,4000r/min離心lOmin沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0x7cm）上清液（含清蛋白、少量a球蛋白和B球蛋白）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0x7cm）用lml0.02mol/LNJ^Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁，繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液（2ml）洗脫，流出液量約lml時開始檢測蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測蛋白質(zhì)用lml0.02mol/LNH4Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁，繼續(xù)>ffl0.02mol/LpH6.5NH4Ac緩沖
7、液（2ml）洗脫，流出液量約lml時開始檢測蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測蛋口質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此吋磺基水楊酸和BaCl2檢測可能同時陽性收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此時磺基水楊酸和BaCl2檢測可能同時陽性繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4Ac緩沖液洗滌繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4Ac緩沖液洗滌土卜fTTLVBaCb檢測SO占陰性BaCb檢測so/?陰性用2?3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡用2?3ml0.02mol/LNH4Ac緩沖液再生平衡（離子交換層析法）（電泳）VV離子交換柱層析純化~>離子用1ml0.02mol/LN
8、H4Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁，繼續(xù)交用0.02mol/LpH6.5NH4Ac緩沖液（3ml）洗
