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《2019血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、純化與鑒定實(shí)驗(yàn)報(bào)告》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫(kù)。
1、血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、純化與鑒定實(shí)驗(yàn)報(bào)告 生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告 姓 名： 學(xué) 號(hào)： 專業(yè)年級(jí)： 組 別： 生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)教學(xué)中心 實(shí)驗(yàn)名稱實(shí)驗(yàn)日期合作者評(píng)分XX血清清蛋白、γ-球蛋白的分離、純化與鑒定實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)指導(dǎo)老師教師簽名李某某 批改日期20XX-06-03格式要求：正文請(qǐng)統(tǒng)一用：小四號(hào)，宋體，倍行距；數(shù)字、英文用TimesNew Roman；標(biāo)題用：四號(hào)，黑體，加粗。需強(qiáng)調(diào)的地方請(qǐng)用藍(lán)顏色標(biāo)出。不得出 現(xiàn)多行、多頁(yè)空白現(xiàn)象。一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹 ?、掌握鹽析法、凝膠層析法、離子交換層析法分
2、離蛋白質(zhì)的原理和基本方法。2、掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法。3、了解柱層析技術(shù)?！ 《?shí)驗(yàn)原理 1、粗提： 蛋白質(zhì)分子能穩(wěn)定存在于水溶液中是因?yàn)橛袃蓚€(gè)穩(wěn)定因素：表面的電荷和水化膜。當(dāng)維持蛋白質(zhì)的穩(wěn)定因素破壞時(shí)，蛋白質(zhì)分子可相互聚集沉淀而析出。鹽在水溶液中電離所形成的正負(fù)離子可吸引水分子，從而奪取蛋白質(zhì)分子上的水化膜，還可中和部分電荷使蛋白質(zhì)分子聚集而沉淀，從而達(dá)到鹽析沉淀蛋白質(zhì)的目的。于血清中各種蛋白質(zhì)顆粒大小、所帶電荷多少及親水程度不同，因此，利用不同濃度的硫酸銨溶液分段鹽析，便可將血清中清蛋白和球蛋白從溶液中沉淀出來(lái)，達(dá)
3、到初步分離清蛋白、球蛋白的目的。2、脫鹽 凝膠層析法利用蛋白質(zhì)與無(wú)機(jī)鹽類之間分子量的差異。當(dāng)溶液通過(guò)凝膠柱時(shí)，溶液中分子量較大的蛋白質(zhì)因?yàn)椴荒芡ㄟ^(guò)網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠顆粒，沿著凝膠顆粒間的間隙流動(dòng)?！ ∷粤鞒梯^短，向前移動(dòng)速度較快，最先流出層析柱。而鹽的分子量較小，可通過(guò)網(wǎng)孔進(jìn)入凝膠顆粒，所以流程長(zhǎng)，向前移動(dòng)速度較慢，較晚流出層析柱。從而可達(dá)到去鹽的目的?！ ?、純化 離子交換是溶液中的離子和交換劑上的離子進(jìn)行可逆的的交換過(guò)程。帶正電荷的交換劑稱為陰離子交換劑；帶負(fù)電荷的交換劑稱為陽(yáng)離子交換劑。本實(shí)驗(yàn)采用的DEAE纖維素是一種陰離子交換劑，溶液
4、中帶負(fù)電荷的離子可與其進(jìn)行交換結(jié)合，帶正電荷的離子則不能，這樣便可達(dá)到分離純化的目的?！ ∶擕}后的蛋白質(zhì)溶液尚含有各種球蛋白，利用它們的等電點(diǎn)的不同可進(jìn)行分離。血清中各種蛋白質(zhì)的pI各不相同，因此，在同一醋酸銨緩沖液中，各蛋白質(zhì)所帶的電荷不同，可以通過(guò)DEAE離子交換層析將血清清蛋白和γ-球蛋白分離出來(lái)。4、純度鑒定 采用醋酸纖維素薄膜電泳對(duì)分離得到的清蛋白和γ-球蛋白進(jìn)行純度鑒定，以正常血清樣品作對(duì)照。比較兩者電泳圖譜可定性判斷純化的清蛋白和γ-球蛋白的純度?！ ∪⒉牧吓c方法：以流程圖示意 材料： 1、樣品：健康人血清 2、試劑：
5、/L的醋酸銨緩沖液、/L的醋酸銨緩沖液、/L的醋酸銨緩沖液、/L的/NH4Ac溶液、飽和硫酸銨溶液、/L磺基水楊酸、/LBaCl2溶液、氨基黑染色液、巴比妥緩沖液、漂洗液。 3、儀器及器材：層析柱、燒杯、移液槍、加樣槍、試管、濾紙、醋酸纖維素薄膜、黑色反應(yīng)板、鐵固定架、螺旋夾、離心管和離心機(jī)、培養(yǎng)皿、載玻片、濾紙、平頭鑷子、電泳槽、直流穩(wěn)壓電泳儀?！ 》椒ǎ骸 〈痔崦擕}純化純度鑒定鹽析取血清，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min沉淀加水溶解上清液 用1ml/LNH4Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁
6、,繼續(xù)用/LNH4Ac凝緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時(shí)開(kāi)始檢測(cè)蛋白質(zhì)膠磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)柱收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d層此時(shí)磺基水楊酸和BaCl2檢測(cè)系可能同時(shí)陽(yáng)性繼續(xù)用2ml/L除NH4Ac緩沖液洗滌鹽BaCl2檢測(cè)SO42-陰性用2~3ml/LNH4Ac緩沖液再生平衡過(guò)葡聚糖凝膠G-25層析柱用1ml/LNH4Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用/LNH4Ac緩沖液(2ml)洗脫，流出液量約1ml時(shí)開(kāi)始檢測(cè)蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的峰液12d此時(shí)磺基水楊酸和BaCl2檢測(cè)可能同時(shí)陽(yáng)性繼續(xù)用2ml/LNH4Ac緩沖液洗
7、滌BaCl2檢測(cè)SO42-陰性用2~3ml/LNH4Ac緩沖液再生平衡離子交換柱層析純化 除鹽后收集的球蛋白離子交換柱層純化過(guò)DEAE-纖維素層析柱除鹽后收集的清蛋白過(guò)DEAE-纖維素層析柱用1ml/LNH4Ac緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,繼續(xù)用/LNH4Ac緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開(kāi)始檢測(cè)蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有蛋白質(zhì)的洗脫液每管10d，連續(xù)收集3管用1ml６mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內(nèi)壁,用約５ml/LNH4AC緩沖液流洗，除去α球蛋白和β球蛋白用/LNH4AC緩沖液(約3ml)洗脫，流出液量約2ml開(kāi)始檢測(cè)
8、蛋白質(zhì)磺基水楊酸檢測(cè)蛋白質(zhì)收集含有清蛋白的洗脫液每管10d，連續(xù)收集2管DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白離子交換柱再生和蛋白純度鑒定取濃度最高的1管
