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《tclr19與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cdna文庫(kù)構(gòu)建與tatctp表達(dá)分析》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、摘要第一部分TcLrl9與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)構(gòu)建小麥與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)的構(gòu)建，對(duì)于研究小麥與葉銹菌互作體系中的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與RNA、蛋白質(zhì)與小分子等的相互作用有著重要意義?！驹囼?yàn)以小麥近等基因系TcLrl9和葉銹菌生理小種366為材料，二者形成不親和組合，分別在接種后4，8，12h取材，采用SMART(Switchingmechanismat5’endofRNAtranscript)技術(shù)，以小麥葉片mRNA為模板，分別用Oligo(dT)18Primer和RandomPrimer反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，通
2、過(guò)同源重組的方法，在酵母菌株Y187中構(gòu)建了兩個(gè)小麥近等基因系TcLrl9與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫(kù)。經(jīng)過(guò)檢測(cè)，文庫(kù)的轉(zhuǎn)化率分別為1．32x106轉(zhuǎn)化子／399pGADT7．Rec和1．O×106轉(zhuǎn)化子／31xgpGADT7．Rec，文庫(kù)滴度分別為2．62x108pfu／mL和3．5l×108pfu／mL，重組率分別為93％和100％。經(jīng)檢驗(yàn)證實(shí)，構(gòu)建的兩個(gè)文庫(kù)具有很好的多樣性，基因長(zhǎng)度分布比較均勻，文庫(kù)效價(jià)均≥1．0x106，完全可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的大規(guī)模篩選，該文庫(kù)的構(gòu)建為下一步篩選互作蛋白，分離和確定更多的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)組件，研究抗病蛋白的
3、結(jié)構(gòu)及功能，建立更完善的小麥抗葉銹信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。這對(duì)于我們深入了解小麥抗葉銹病的分子機(jī)制，克隆小麥抗葉銹重要相關(guān)基因及利用基因工程培育新的抗葉銹小麥品種具有重要意義。關(guān)鍵詞：SMART技術(shù)；同源重組；酵母雙雜交；cDNA文庫(kù)；RT-PCR9第二部分TaTCTP在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中的表達(dá)分析翻譯控制腫瘤蛋I芻(translationallycontrolledtumorprotein，TCTP)，是一種高度保守的、高表達(dá)的真核蛋白家族，廣泛存在于動(dòng)物、植物及酵母中，并具有高度的同源性。大量的研究表明：TCTP是一種多功能蛋白，尤其在復(fù)雜的生命活動(dòng)中
4、具有極其重要的作用。最初認(rèn)為TCTP是一類生長(zhǎng)相關(guān)蛋白，近年大量的研究結(jié)果提示TCTP可能具有非常重要的生物學(xué)功能，包括組胺釋放功能、微管結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白、抗凋亡作用、調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的進(jìn)程和惡性轉(zhuǎn)移、抑制Na+、K+-ATPase活性、抗氧化、具有分子伴侶活性的熱激蛋白及抗瘧疾作用等。本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期以來(lái)從事小麥(TriticumaestivumL．)抗葉銹菌(Pucciniatriticina)侵染生理機(jī)制的研究工作，已經(jīng)初步i正nfJCa2+、ROS和細(xì)胞骨架等參與了小麥抵抗葉銹菌侵染的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程；并通過(guò)抑制性差減雜交技術(shù)，構(gòu)建了TcLrl9抗葉銹HR反應(yīng)
5、早期的差異基因表達(dá)文庫(kù)，在該文庫(kù)中發(fā)現(xiàn)陀即基因在接菌后8h和16h時(shí)大量表達(dá)。結(jié)合目前對(duì)TCTP的研究進(jìn)展，初步判斷TaTCTP可能參與了小麥對(duì)葉銹菌的抗性反應(yīng)。為了進(jìn)一步探討TaTCTP的功能，有必要制備TaTCTP的特異性抗體，因?yàn)樗诘鞍踪|(zhì)的定位、定量分析及生理功能研究中是最有效、最特異的材料。本試驗(yàn)首先根據(jù)已知序列，以小麥近等基因系TcLrl9葉片eDNA為模板，擴(kuò)增獲得了小麥翻譯控制腫瘤蛋白基因TaTCTP，構(gòu)建到表達(dá)載體pET30a(+)．GST中并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)TaTCTP融合蛋白。經(jīng)篩選獲得該蛋白的
6、最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件：LB培養(yǎng)基37。C培養(yǎng)至菌體OD600=0．5～O．8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0．1mmol／L，28℃誘導(dǎo)20h。進(jìn)一步利用Ni-NTA純化了TaTCTP融合蛋白，經(jīng)SDS．PAGE分離后由考馬斯亮藍(lán)染色證明已除去大部分雜蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度約為1．3mg／mL，達(dá)到了抗體制備的要求。以純化的TaTCTP融合蛋白為抗原，免疫新西蘭兔制備了抗小麥翻譯控制腫瘤蛋白的兔抗血清。TaTCTP兔抗血清的獲得為進(jìn)一步探討TaTCTP在小麥與葉銹菌互作過(guò)程中的時(shí)空分布特征及功能奠定了基礎(chǔ)。以小麥TcLrl9接菌366后不同時(shí)間點(diǎn)葉片為材料，采用實(shí)時(shí)熒光
7、定量PCR檢測(cè)TaTCTP基因在mRNA水平的表達(dá)變化，Westernblotting檢測(cè)TaTCTP蛋白的表達(dá)量變化。試驗(yàn)結(jié)果表明，小麥近等基因系TcLrl9接種葉銹菌小種366后，TaTCTPmRNA表達(dá)量在接種后2h時(shí)表現(xiàn)上調(diào)表達(dá)，并隨互作時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)量逐漸上升并在24h時(shí)達(dá)到最大；而未接種對(duì)照中，TaTCTPmRNA的表達(dá)量變化不明顯。從Westernblotting結(jié)果來(lái)看，所制備的抗體對(duì)小麥全蛋白質(zhì)具有很高的特異性，獲得的信號(hào)基本上呈現(xiàn)一條比較清晰的主帶。但無(wú)論是接菌處理還是未接種對(duì)照處理，TaTCTP在蛋白水平的表達(dá)量變化均無(wú)明顯區(qū)別。以上結(jié)
8、果表明TaTCTP在轉(zhuǎn)錄水平受葉銹菌侵
