tclr19和葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cdna文庫構(gòu)建與tatctp表達分析

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1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得邐j絲壅些太堂或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。日的規(guī)定，查閱和借據(jù)庫進行日摘要第一部分TcLrl9與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫構(gòu)建小麥與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫的構(gòu)建，對于研究小麥與葉銹菌互作體系中的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)與RNA、蛋白質(zhì)與小分子等的相互作用有著

2、重要意義。’本試驗以小麥近等基因系TcLrl9和葉銹菌生理小種366為材料，二者形成不親和組合，分別在接種后4，8，12h取材，采用SMART(Switchingmechanismat5’endofRNAtranscript)技術(shù)，以小麥葉片mRNA為模板，分別用Oligo(dT)18Primer和RandomPrimer反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，通過同源重組的方法，在酵母菌株Y187中構(gòu)建了兩個小麥近等基因系TcLrl9與葉銹菌互作早期的酵母雙雜交cDNA文庫。經(jīng)過檢測，文庫的轉(zhuǎn)化率分別為1．32x106轉(zhuǎn)化子／399pGADT7．Rec和1．O×106轉(zhuǎn)化

3、子／31xgpGADT7．Rec，文庫滴度分別為2．62x108pfu／mL和3．5l×108pfu／mL，重組率分別為93％和100％。經(jīng)檢驗證實，構(gòu)建的兩個文庫具有很好的多樣性，基因長度分布比較均勻，文庫效價均≥1．0x106，完全可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)相互作用的大規(guī)模篩選，該文庫的構(gòu)建為下一步篩選互作蛋白，分離和確定更多的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)組件，研究抗病蛋白的結(jié)構(gòu)及功能，建立更完善的小麥抗葉銹信號轉(zhuǎn)導(dǎo)網(wǎng)絡(luò)奠定了基礎(chǔ)。這對于我們深入了解小麥抗葉銹病的分子機制，克隆小麥抗葉銹重要相關(guān)基因及利用基因工程培育新的抗葉銹小麥品種具有重要意義。關(guān)鍵詞：SMART技術(shù)；同源重組；酵母

4、雙雜交；cDNA文庫；RT-PCR9第二部分TaTCTP在小麥與葉銹菌互作過程中的表達分析翻譯控制腫瘤蛋I芻(translationallycontrolledtumorprotein，TCTP)，是一種高度保守的、高表達的真核蛋白家族，廣泛存在于動物、植物及酵母中，并具有高度的同源性。大量的研究表明：TCTP是一種多功能蛋白，尤其在復(fù)雜的生命活動中具有極其重要的作用。最初認為TCTP是一類生長相關(guān)蛋白，近年大量的研究結(jié)果提示TCTP可能具有非常重要的生物學(xué)功能，包括組胺釋放功能、微管結(jié)合蛋白、鈣結(jié)合蛋白、抗凋亡作用、調(diào)節(jié)細胞周期的進程和惡性轉(zhuǎn)移、抑制Na+、

5、K+-ATPase活性、抗氧化、具有分子伴侶活性的熱激蛋白及抗瘧疾作用等。本實驗室長期以來從事小麥(TriticumaestivumL．)抗葉銹菌(Pucciniatriticina)侵染生理機制的研究工作，已經(jīng)初步i正nfJCa2+、ROS和細胞骨架等參與了小麥抵抗葉銹菌侵染的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程；并通過抑制性差減雜交技術(shù)，構(gòu)建了TcLrl9抗葉銹HR反應(yīng)早期的差異基因表達文庫，在該文庫中發(fā)現(xiàn)陀即基因在接菌后8h和16h時大量表達。結(jié)合目前對TCTP的研究進展，初步判斷TaTCTP可能參與了小麥對葉銹菌的抗性反應(yīng)。為了進一步探討TaTCTP的功能，有必要制備TaTC

6、TP的特異性抗體，因為它在蛋白質(zhì)的定位、定量分析及生理功能研究中是最有效、最特異的材料。本試驗首先根據(jù)已知序列，以小麥近等基因系TcLrl9葉片eDNA為模板，擴增獲得了小麥翻譯控制腫瘤蛋白基因TaTCTP，構(gòu)建到表達載體pET30a(+)．GST中并將其轉(zhuǎn)化大腸桿菌。利用大腸桿菌表達系統(tǒng)，通過IPTG誘導(dǎo)表達TaTCTP融合蛋白。經(jīng)篩選獲得該蛋白的最佳誘導(dǎo)表達條件：LB培養(yǎng)基37。C培養(yǎng)至菌體OD600=0．5～O．8時，加入IPTG至終濃度為0．1mmol／L，28℃誘導(dǎo)20h。進一步利用Ni-NTA純化了TaTCTP融合蛋白，經(jīng)SDS．PAGE分離后由考

7、馬斯亮藍染色證明已除去大部分雜蛋白，測定蛋白質(zhì)濃度約為1．3mg／mL，達到了抗體制備的要求。以純化的TaTCTP融合蛋白為抗原，免疫新西蘭兔制備了抗小麥翻譯控制腫瘤蛋白的兔抗血清。TaTCTP兔抗血清的獲得為進一步探討TaTCTP在小麥與葉銹菌互作過程中的時空分布特征及功能奠定了基礎(chǔ)。以小麥TcLrl9接菌366后不同時間點葉片為材料，采用實時熒光定量PCR檢測TaTCTP基因在mRNA水平的表達變化，Westernblotting檢測TaTCTP蛋白的表達量變化。試驗結(jié)果表明，小麥近等基因系TcLrl9接種葉銹菌小種366后，TaTCTPmRNA表達量在接

8、種后2h時表現(xiàn)上調(diào)表達，并隨互作時間的