廣西沼澤型水牛γ-干擾素基因的克隆與原核表達

《廣西沼澤型水牛γ-干擾素基因的克隆與原核表達》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。

1、[墮丕蘭!!墮堡塑主堂堡絲塞￡墮塑豎型查±!：±墊莖箜塞墮蘭墮墊塞鯊廣西沼澤型水牛丫一干擾素基因的克隆與原核表達摘要干擾素(IFN)是由干擾素誘生劑誘導生物細胞后所產生的一類高活性多功能的糖蛋白。干擾素分為I型和II型，r干擾素(IFN嘲屬于II型干擾素，是由T細胞和NK細胞產生的，具有廣譜抗病毒作用，也具有上調主要組織相溶性復合物II(majorhistocompatib．

2、jtycompJe×II，MHCII)類抗原分子的表達等作用，是影響機體細胞和體液免疫反應的一類具有多種調節(jié)效應的細胞因子。本實驗從健康沼澤型水牛靜脈無菌采血，分離外周

3、血單個核細胞(PBMC)，用刀豆素A(ConcanavaI．nA，ConA)誘導培養(yǎng)13、17h后，提取細胞總RNA，用水牛lFN-丫基因特異性引物通過RT-PCR擴增了水牛JFN_丫的完全編碼區(qū)cDNA序列和成熟肽編碼區(qū)cDNA序列，將其克隆至IJpMDl8-T載體中，經序列分析表明，水牛IFNl編碼區(qū)cDNA共有501bp，其序列與GenBank上報道的印度水牛JFNl核苷酸序列同源性高達99．6％，與牛、羊、豬、狗、馬、人和鼠的同源勝分別為97．8％、96．嘶、85．8％、82．4％、81．o％、75．05；}n60．7％。氨基酸序列與

4、印度水牛同源性1005．與牛、羊、豬、狗、馬、人和鼠的同源性分別為97．6％、95．2％、77．1％、77．1％、76．5％、60．8％冪940．6％。．44}IFN-y成熟肽編碼區(qū)基因亞克隆到表達載體pET-32a+中，構建重組表達質粒pET-mIFNl，重組質粒轉化大腸桿菌匯co／i)BL21，于37。C經IPTG誘導表達7小時，SDS-PAGE分析表明該基因在大腸桿菌中獲得了高水平表達，表達的融合蛋白分子量約為35kD，且表達產物占菌體總蛋白的43．6％。本試驗成功地克隆、表達了水牛JFNl，為下一階段水牛lFN_丫重組蛋白生物學特性及

5、其應用的研究奠定了基礎。關鍵詞：沼澤型水牛：Y-干擾素：基因克?。涸吮磉_[?？?；!堂旦堡圭堂垡迨奎亡耍塑翌型查±!：王墊壅盟塞墮量堡堡壅鯊CLONINGANDPROKARYOTICEXPRESSIONOFGUANGXISWAMPTYPEBUFFALOINTERFERON-,／GENEABSTRACTInterferonisakindofhi曲lyactiveandmulti-functionalglucoproteinproducedbyactivatedcells．InterferonisdevidedintoclassIandclas

6、sII．Interferon吖(ⅢN—DbelongstoclassII．BuffaloIFN-?isanantivimlcytokineproducedbyactivatedTcellsandNKcells．ItupregulatsMHCIIantigenexpression，influencesthecellularandhumoralimmuneresponsesandhaspleiotropicregulatoryeffectsonimmunesystem，Inthiswork，thetotalRNAwasextractedfromp

7、eripheralbloodmononuclearcells(PBMC)，isolatedfromthreehealthyswamptypebuffaloandstimulatedwithConAfor13and17hours，respectively．AndthecDNAofbuffaloIFN-ygenewasamplifiedbyRT—PCRusingapairofprimersdesignedaccordingtothepublishedbovineIFN吖genesequence．ThePCRproductwasclonedinto

8、pMDl8-Tvector．Then，sixofthepositiverecombinantclonesweresequencedandanalyzed．ComparisonofthesequencedIFN吖withthereportedIndianbuffaloIFN—vsequenceinGeneBankrevealed99．6％identityatthenucleotidelevel，andshares97．8％，96．0％，85．8％，82．4％，81．O％，75．O％and60．7％identitieswithbovine，goa

9、t，pig，dog，horse，humanandmouseIFN吖geneinnucleotide，respectively．Comparingwiththerep