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《戊型肝炎病毒中和抗體競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立及評價》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、東南大學碩士學位論文戊型肝炎病毒中和抗體競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立及評價碩士研究生：田華導師：孟繼鴻教授王立新副教授『中文摘要1戊型肝炎(HepatitisE，HE)是一種經(jīng)糞口途徑傳播的急性傳染病，在世界各地尤其是發(fā)展中國家廣泛流行，在發(fā)達國家也有散發(fā)。HE病死率約為O．4％，遠較其他各型肝炎高?；颊叨酁榍鄩涯辏衅趮D女病死率高達20％[I-2l，給社會帶來了很大危害。近年來發(fā)現(xiàn)在豬等動物中也有廣泛的戊型肝炎病毒(HepatitisEVirus，HEV)感染，使該病成為一種人畜共患病【ISl。目前HE尚無特異的治療方法，也無主動
2、和被動免疫制劑可供預防。國內外學者均在致力于HEV疫苗的研究。而衡量疫苗是否有預防疾病作用的標準，就是看疫苗能否誘導機體產生中和抗體。中和抗體不同于一般的抗體，它能與病毒結構蛋白上的中和抗原表位結合，阻斷病毒與敏感細胞的結合，從而阻lE該病毒入侵敏感細胞，使病毒失去感染性，對機體有保護作用，對疾病的診斷、預防和預后起著重要作用。檢測中和抗體的常用方法有動物體內試驗和細胞培養(yǎng)體外試驗兩種，但目前對HEV敏感的動物只有非人靈長類動物16J，使用非人靈長類動物建立動物模型，價格昂貴，方法繁瑣，試驗周期長，動物飼養(yǎng)要求高，耗費大量的人力物
3、力，難以在基層廣泛使甩。另外，由于HEV缺乏有效的細胞培養(yǎng)體系．傳統(tǒng)的體外中和試驗鑒定難以進行，1997年MengIIol鑄發(fā)明了基于PCR和細胞培養(yǎng)的體外中和試驗并用于HEV中和抗體的檢測，但該體外中和試驗需要細胞培養(yǎng)及RT-PCR技術。方法繁瑣，也難以普遍推廣應用。針對HEV中和抗體檢測存在的問題。本研究的目的是建立一種簡便易行的檢測HEV中和抗體的方法，并進行初步評價。本研究利用我們先前獲得的能夠穩(wěn)定分泌HEV中和性單克隆抗體(MeAb)的雜交瘤細胞株．大量制備和純化HEV中和性MeAb，并進行酶標記，使待測樣本中的HEV中
4、和抗體與酶標記HEV中和性MeAb競爭結合包被抗原上的HEV中和抗原表位，最后根據(jù)酶作用底物顯色反應減弱的程度，實現(xiàn)對生物學樣本中的HEV中和抗體的競爭酶聯(lián)免疫檢測。本研究分為三個部分，具體研究結果如下：一．HEV中和性單克隆抗體的大量制備、鑒定和純化本實驗室通過B淋巴細胞雜交瘤技術，以p166Chn和p166Bur免疫小鼠后獲得3株雜交瘤細胞株5G5、lGlo和3Gj。這3株細胞所分泌的McAb均不與單獨包被的GST發(fā)生結合．是針對HEV的特異性抗體。它們分泌的MeAb能和7種不同基因型來源的p166均發(fā)生陽性反應，為p166共
5、同型MeAb。用這3株雜交瘤細胞制備出大量的MeAb，并對MeAb進行了HEV中和活性的鑒定，證實它們具有中和HEV的作用，是HEV中和性MeAb·分別用正辛酸法，DEAE52陰離子交換層析法，Protein-G親和層析法3種不同的方法對MeAb進行純化，并對這3種純化方法的結果進行比較。我們將純化得到的產物系列稀釋后進行間接ELISA檢測抗體滴度，顯示出用正辛酸法和Protein·G親和層析的方法純化的MeAb滴度比DEAE52陰離子交換層析法高，分別可達l：100(5G5)tl：10’(1Glo)l：10’(3GI)。經(jīng)SDS
6、，PAGE．純化后的MeAb僅在重、輕鏈位置出現(xiàn)明顯條帶，表明純化后的MeAb純中文摘要度較高。最終選用較經(jīng)濟、簡便的正辛酸法來純化McAb，選用抗體滴度高，純度高的McAb5G5作為下一步酶標記的McAb。二．HEV中和性單克隆抗體的酶標記采用改良的過碘酸納法用辣根過氧化物酶(HRP)標記McAb5G5。成功的制備出了高質量的HRP酶標記McAb5G5。以不同基因型和弧型HEV重組抗原p166的混合物p166Mix為包被抗原，用直接ELISA法檢測HRP5G5，方陣滴定的結果顯示，當抗原稀釋度為1：500，HRP-5G5稀稈度為
7、1：400時．013450最接近于1．O。經(jīng)過計算，標記物中HRP的含量為0．42mg／mh5G5含鼉?yōu)?．34mg／ml：酶／抗體摩爾比為1．4：1。三．HEV中和抗體競爭酶聯(lián)免疫檢測方法的建立及評價我們用p166Mix抗原和中和性MeAbHRP5G5，建立了HEV競爭ELISA的方法，檢測抗．HEV中和性抗體。確定最佳包被抗原稀釋度為l：800。選擇合適的抗原包被液為pH9．6的0．05M碳酸鹽緩沖液。酶標微孔板為深圳國產產品。酶標抗體HRP一5G，的最適稀釋度為1：400。酶標抗體稀釋液為0．01MPBS溶液。標本用量為50
8、ul血清標本。以本方法檢鍘HEVORF2重組蛋白疫苗免疫的恒河猴系列血清，免疫組自免疫4周開始，血清抗一HEV中和抗體有明顯升高，并于8-9周后達到高峰，于6周左右開始中和抗體競爭抑制率>／50％。對照組自病毒攻擊4周后血清抗．HEV中和抗體開始升
