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《復(fù)制型hbv小鼠模型建立與可誘導(dǎo)肝細胞特異性表達upa轉(zhuǎn)基因小鼠制備》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、碩士學(xué)位論文摘要目的l、構(gòu)建及鑒定水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型，探討該模型在HBV疫苗評價中的應(yīng)用。2、制備可誘導(dǎo)肝細胞特異性表達uPA轉(zhuǎn)基因小鼠，為人肝嵌合體小鼠模型的建立奠定基礎(chǔ)。方法1、復(fù)制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗評價中的應(yīng)用(1)∥訟V．HBVl．3質(zhì)粒的鑒定：含腺相關(guān)病毒倒轉(zhuǎn)末端重復(fù)序列元件與包含1．3個拷貝HBV基因組(a’w亞型)的HBV表達質(zhì)粒pA舭HBVl．3(由中國疾控中心病毒病所譚文杰教授惠贈)，酶切鑒定并將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hllh7肝癌細胞系，ELISA方法檢測HBsAg、HBeAg的分
2、泌表達水平。，(2)水動力法HBV小鼠模型的構(gòu)建：將p兒舭HBVl．3質(zhì)粒經(jīng)高壓水動力法尾靜脈注射C57BL／6小鼠，分別于注射后10天、30天、60天采集血液和肝組織標本，ELISA檢測血清HBsAg、HBcAg表達；R砌．TimePCR檢測血清及肝組織病毒載量；HE染色、免疫組化染色檢測肝組織病理學(xué)改變及病毒抗原在肝組織中的定位及表達。．(3)水動力法HBV小鼠模型的優(yōu)化：采用免疫抑制劑地塞米松注射液(DEX)腹腔注射小鼠，O．2ml／只／次(50m班g)隔日一次連續(xù)3次，建立免疫功能抑制小鼠模型，在此基礎(chǔ)
3、上制備乙肝病毒轉(zhuǎn)染小鼠模型，于注射后每周采集尾靜脈血，進行血清HBSAg、HBeAg檢測及病毒載量檢測。(4)水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型的鑒定：利用HBV商品化疫苗(商品名：安在時，成分：HBsAg)免疫小鼠，2pg／只，14天1次，共2次，生理鹽水為對照，200肛l／只：第2次加強免疫14天后用水動力法轉(zhuǎn)染pAAv．HBVl．3，進行免疫保護性實驗，在不同時間點采集尾靜脈血，ELISA檢測血清HBsAg、HBeAg，Real—TimePCR檢測血清病毒載量。(5)水動力法轉(zhuǎn)染HBV小鼠模型在疫苗評價中的應(yīng)用：
4、用重組腺病毒(AdS)免疫C57BL／6小鼠，同時設(shè)置安在時疫苗(商品化疫苗)及生理鹽水為對照。分別于首次免疫前及每次免疫后10天采集尾靜脈血，ELISA檢測血清HBsAb，最后1次免疫14天后尾靜脈水動力法注射pAAV-HBvl-3質(zhì)粒溶液1．6m1(20“∥只)，于不同時間點采集尾靜脈血，ELISA檢測血清HBsAg、HBeAg，Real．TimePCR檢測血清病毒載量。1摘要碩士學(xué)位論文2、可誘導(dǎo)肝細胞特異性表達uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備(1)pTet．0n．舢b啪in轉(zhuǎn)基因小鼠的制備：構(gòu)建及鑒定含血清白蛋白
5、增強子和啟動子序列的pTet．0n—Albumin載體，在細胞水平驗證越b啪iIl啟動子轉(zhuǎn)錄活性，通過將pTet．on．舢b啪in載體顯微注射B6／CBA雜合一代受精卵原核細胞的方法獲得轉(zhuǎn)基因首建鼠，然后與野生型C57BL／6雜交，PCR篩選轉(zhuǎn)基因陽性小鼠，ImPCR、Wbst鋤blot鑒定rtTAmImA及蛋白表達。(2)pTRE2．uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備：構(gòu)建及鑒定含小鼠uPA基因的pTRE2．uPA載體，與pT睢on質(zhì)粒共轉(zhuǎn)Huh7細胞系，細胞水平鑒定uPA的表達及其生物活性；通過將pTRE2-uPA載體
6、顯微注射B6／CBA雜合一代受精卵原核細胞的方法獲得轉(zhuǎn)基因首建鼠，與野生型C57B啪雜交，PCR篩選轉(zhuǎn)基因陽性小鼠?！?3)可誘導(dǎo)肝細胞特異性表達uPA轉(zhuǎn)基因小鼠的制備：將已獲得穩(wěn)定的且在小鼠肝細胞特異性表達Albumin．rtTA的轉(zhuǎn)基因小鼠與T砌j12一l姚轉(zhuǎn)基因小鼠雜交，子代鼠Dox誘導(dǎo)，誘導(dǎo)12周后處死小鼠，取血清和肝組織進行ALT和肝組織uPA表達及病理學(xué)檢測，獲得可誘導(dǎo)肝細胞特異性表達uPA轉(zhuǎn)基因小鼠。結(jié)果．1、復(fù)制型HBV小鼠模型的建立及其在疫苗評價中的應(yīng)用(1)pA舭HBVl．3質(zhì)粒的鑒定結(jié)果：
7、將包含1．3倍全長HBV基因組的質(zhì)粒pAAV-HBvl．3酶切分析與預(yù)期結(jié)果相符，pAAV-HBVl．3脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染H11h7細胞72h后收集細胞培養(yǎng)上清，ELISA方法檢測HBsAg、HBeAg均為陽性，OD值分別為0．309及1．279，對照(未轉(zhuǎn)染的Huh7細胞培養(yǎng)上清)均為陰性。(2)水動力法HBV小鼠模型的鑒定結(jié)果：C57B“6小鼠尾靜脈水動力法注射pA觚乙HBVl．3，10天時通過ELISA方法檢測小鼠血清HBsAg、HBeAg，結(jié)果均為陽性，感染率為100％；30天、60天時血清HBsAg、HBeA
8、gELISA檢測結(jié)果均為陰性。Rcal．脅ePCR檢測小鼠血清及肝組織病毒載量，結(jié)果顯示，注射質(zhì)粒10天、30天及60天時實驗組小鼠血清及肝組織病毒載量明顯高于對照組，且在10天時達高峰，以后隨時間延長，血清及肝組織中病毒載量降低。免疫組化染色可見，10天時注射pAAV．HBVl．3小鼠肝組織均存在HBsAg、HBcAg陽性細胞，注射HBV質(zhì)粒30天和60天時小鼠肝組織未檢測到HBsA
