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《內(nèi)皮素受體a+sirna對大鼠腎臟缺血再灌注損傷保護作用的研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、復(fù)E大學(xué)《±學(xué)＆*立發(fā)的基因沉默現(xiàn)象t其機制是通過阻礙特定基因的翻譯或轉(zhuǎn)錄來抑制基因表達。當(dāng)細(xì)胞中導(dǎo)入與內(nèi)源性m剛A編碼區(qū)同源的職鏈烈A時，該刪^發(fā)生降解而導(dǎo)致基因表達沉默“?。在哺乳動物中長度為21～23nt的小RNA分子是引起RNA干擾現(xiàn)象的直接原園?”1。這種小RNP,分子被稱之為小干擾RNMsmailinterferingRNA，siRNA)。在RNA干擾中一個非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可與雙鏈RNA結(jié)臺，并將其剪切成21～23nt及3’端突出的小分子RNA片斷．即siRNA。隨后sil
2、ⅫNA與若干個蛋白組成的，RNA引起的稱之為RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA_inducedsi[encingcomplex，RISC)結(jié)合，解旋成單鏈，并由該復(fù)合體主導(dǎo)RNAi效應(yīng)“?。RISC被活化后．活化型RISC受已成單鏈的siRNA引導(dǎo)，序列特異性地結(jié)合在標(biāo)靶mRNA上并切斷標(biāo)靶IIlRNA，{{拄靶mRNA的特異性分解。由此．可達成特異性的轉(zhuǎn)錄后基因沉默從而抑制相關(guān)蛋白的表達。因此，RNAi在基因功能研究以及疾病治療方面有者巨大的價值?；蛑委熓且环N將特殊基因轉(zhuǎn)染至靶細(xì)胞以調(diào)節(jié)目的基因表達的治療形式?；蛑委煹那疤?/p>
3、是如何特異性的將目標(biāo)基因進達靶器官、靶細(xì)胞，而在運送的過程中又不會被降解。RNAi作為一種基因治療手段面臨著同樣的問胚?；瘜W(xué)臺成的siRNA易降解．作用時間短暫，不適于體內(nèi)應(yīng)用。體內(nèi)的PdoAi研究往往需要一種安全，轉(zhuǎn)染效率高，作用時間相對較長，靶向性強的載體。就腎臟基因治療而言，主要包括非病毒載體，病毒載體種類型““。非病毒載體包括襟質(zhì)粒(nakedplasmid)和增強的裸質(zhì)粒(enhancednakedplasmid)。由于裸質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染效率普遍較低，因此有一些增強其轉(zhuǎn)染效率的方法。主要包括兩類，一類是物理方法．包括使
4、用電穿}L法在細(xì)胞膜上制造臨時的微孔，以及對靶器官進行加用微泡劑的超聲干預(yù)：另一類是化學(xué)方法，主要是指使用各種脂質(zhì)體，包括病毒融合的脂質(zhì)體(如HvJIiposome)。病毒載體，包括腺病毒，腺相關(guān)病毒，逆轉(zhuǎn)錄病毒以及慢病毒等。雖然病毒載體在轉(zhuǎn)染效率上較非病毒載體明顯增強，f黽其毒性和免疫原性的問題仍待解決‘“。本課題采用質(zhì)粒載體介導(dǎo)的針對ETRA的siRNA．在體外試驗中篩選能高效抑制腎臟ETRA基因表達的siRNA。利用大鼠腎臟缺血_冉灌注損傷模型，研究ETRAsiRNA對腎臟缺血再灌注損傷的保護作用．并對其作用機制進行
5、初步探索?！?!!!!．!!!!!第一部分質(zhì)粒介導(dǎo)的ETRAsiRNA的構(gòu)建及體外篩選材料與方法l實驗材料11細(xì)胞與試劑(1)細(xì)胞系：A—10(大鼠胸主動脈平滑肌細(xì)胞)購自ATCC。(2)主要試劑iDMEM低糖培養(yǎng)基Hyclone公司2．胎牛血清(Fetalcalfserum)Hyclone公司3．胰蛋白酶(Trypsin)Gibco公司4pRNATU61／Neo質(zhì)粒載體Genscript公司5．質(zhì)粒抽提試劑盒Qiagen公司6．LipofectaalineLTX轉(zhuǎn)染試劑Invitrogen公司7．OptiMEMIRed
6、ucedSerumMediumInvitrogen公司8胎牛血清Hyclone公司2主要設(shè)備1．HeraeusC02恒溫培養(yǎng)箱Heraeus公司2．倒置顯微鏡Olympus公司3熒光顯微鏡Olympus公司4超凈工作臺蘇州凈化設(shè)各公司5．恒溫水浴箱PolyScience公司6．Milli—QBiocel純水儀m11ipore公司7手提紫外燈upland公司8電泳儀(BioRadPower／PAC3000)BioRad公司9．GelDoe2000GelOocumentfltionSystemBioRad公司10．一80X2低
7、溫冰箱(HetoUltraFreeze)HetoUltra公司1I．EppendorfBiophotometerEppendorf公司12．GeneAInpPCRSystem2400PerkinElmer公司t3．Centrifuge5840R低溫離心機Eppendorf公司復(fù)B大學(xué)碩士學(xué)位論文司4Rotor—Gene3000熒光定量PER儀CorbettResearch公2．實驗方法2lA—lO細(xì)胞的復(fù)蘇和傳代21_1細(xì)胞的復(fù)蘇將液氮罐中取出的A10細(xì)胞凍存管迅速置于37"C水浴中，使凍存細(xì)胞快速融化，1000rpm離心
8、10min，細(xì)胞沉淀用lmI含10％胎牛血清DMEM低糖培養(yǎng)基重懸后．細(xì)胞懸液移入6cm培養(yǎng)皿．加培養(yǎng)液至總體積至3m】，置于37"C、5％c0：、飽和濕度細(xì)胞培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)。24h后于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否貼壁生長。212細(xì)胞的培養(yǎng)及傳代貼壁生長的細(xì)胞2～3天更換培養(yǎng)液一次，細(xì)胞匯片達7080％時
