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《dsrna介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因加工番茄抗cmv研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、分類(lèi)號(hào)：密級(jí)：學(xué)號(hào)：2009107061單位代碼：10759石河子大學(xué)碩士學(xué)位論文dsRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因加工番茄抗CMV研究學(xué)位申請(qǐng)人劉煒煒指導(dǎo)教師黃家風(fēng)教授申請(qǐng)學(xué)位門(mén)類(lèi)級(jí)別農(nóng)學(xué)碩士學(xué)科、專業(yè)名稱植物病理學(xué)研究方向植物病毒及病毒病害所在學(xué)院農(nóng)學(xué)院中國(guó)·新疆·石河子2012年6月DsRNA-mediatedResistancetoCucumbermosaicvirus(CMV)inTransgenicProcessingTomatoPlantsADissertationSubmittedtoShiheziUniversityIn
2、PartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofAgricultureByLiuWeiwei(PlantVirology)DissertationSupervisor:AssociateProfessorHuangJiafengJune,2012石河子大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明及使用授權(quán)聲明學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人所呈交的學(xué)位論文是在我導(dǎo)師的指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含其他個(gè)人已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。對(duì)本
3、文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中作了明確的說(shuō)明并表示謝意。研究生簽名：時(shí)間：年月日使用授權(quán)聲明本人完全了解石河子大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文并向國(guó)家主管部門(mén)或指定機(jī)構(gòu)送交論文的電子版和紙質(zhì)版。有權(quán)將學(xué)位論文在學(xué)校圖書(shū)館保存并允許被查閱。有權(quán)自行或許可他人將學(xué)位論文編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)提供檢索服務(wù)。有權(quán)將學(xué)位論文的標(biāo)題和摘要匯編出版。保密的學(xué)位論文在解密后適用本規(guī)定。研究生簽名：時(shí)間：年月日導(dǎo)師簽名：時(shí)間：年月日摘要黃瓜花葉病毒（Cucumbermosaicvirus,CMV）是一種寄主范圍非常廣
4、范的植物病毒，是造成新疆加工番茄壞死條斑病的重要因素，嚴(yán)重影響加工番茄的品質(zhì)和產(chǎn)量。利用基因工程原理將病毒本身的一些基因轉(zhuǎn)化到植物基因組中獲得抗性植株是當(dāng)前病毒病防治的主要途徑。本文的主要研究?jī)?nèi)容與結(jié)果如下：1.根據(jù)已報(bào)道CMV復(fù)制酶基因和2b基因設(shè)計(jì)特異性引物，從石河子實(shí)驗(yàn)站采集表現(xiàn)嚴(yán)重花葉癥狀的加工番茄，利用RT-PCR分別擴(kuò)增兩個(gè)片段，克隆并測(cè)序。其中CMV復(fù)制酶基因?yàn)?627位核苷酸開(kāi)始的546個(gè)核酸片段，同源性比較表明，它與已報(bào)道的AJ319666的同源性最高，為98.3%；擴(kuò)增得到的2b基因全長(zhǎng)336個(gè)核苷酸，編碼
5、111個(gè)氨基酸。序列比對(duì)表明，擴(kuò)增得到的CMV2b基因與已報(bào)道2b基因DQ873567的核苷酸序列同源性最高，達(dá)97.0%，與其氨基酸相似性達(dá)到97.0%。2.根據(jù)已測(cè)CMVRep基因和CMV2b基因的序列設(shè)計(jì)特異引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增到CMV379bp△Rep基因片段和336bp2b基因片段。然后將2個(gè)目的基因片段分別以反向重復(fù)的方式與大豆內(nèi)含子相連，得到含有目的基因片段反向重復(fù)序列的重組質(zhì)粒pBlueSK-Intron△Rep(i/r)和pBlueSK-Intron2b(i/r)。再用限制性內(nèi)切酶切下包含Intron在內(nèi)的反
6、向重復(fù)的目的基因片段，并定向插入到植物表達(dá)載體pBIN438上，分別構(gòu)建成功含CMV基因的植物表達(dá)載體pBIN438△Rep(i/r)和pBIN4382b(i/r)。酶切和PCR鑒定證明所構(gòu)建的載體與預(yù)期的設(shè)計(jì)完全一致。3.通過(guò)對(duì)里格兒87-5和亞心98-1兩個(gè)加工番茄栽培品種的離體再生體系的研究，結(jié)果表明，激素的種類(lèi)和濃度對(duì)加工番茄外植體出愈率的影響沒(méi)有差異，但是誘導(dǎo)形成的愈傷組織形態(tài)和不定芽存在差異，ZT與IAA組合對(duì)不定芽的誘導(dǎo)效果高于6-BA與IAA組合，不定芽誘導(dǎo)率最高的培養(yǎng)基組合為MS+ZT0.5mg/L+IAA0
7、.2mg/L。并且品種之間存在差異，亞心98-1比里格爾87-5更易產(chǎn)生較高比率的正常芽。再生芽在1/2MS+0.1mg/LIAA生根培養(yǎng)基上能正常生根。建立了加工番茄亞心98-1優(yōu)化的離體再生體系。4.通過(guò)三親交配法，將植物表達(dá)載體pBIN438△Rep(i/r)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化煙草葉盤(pán)和加工番茄子葉葉盤(pán)，最終成功獲得33株轉(zhuǎn)基因煙草和6株轉(zhuǎn)基因番茄植株。對(duì)兩種抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出了目標(biāo)片段，初步表明△Rep基因反向重復(fù)片段已經(jīng)整合到煙草和加工番茄基因組中。5.用同樣的方法，將植物表達(dá)載體pBIN
8、4382b(i/r)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105，經(jīng)過(guò)葉盤(pán)法進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，最終成功獲得11株轉(zhuǎn)基因煙草和5株轉(zhuǎn)基因番茄植株。對(duì)兩種抗性植株進(jìn)行PCR檢測(cè)，擴(kuò)增出了目標(biāo)片段，初步表明2b基因反向重復(fù)片段已經(jīng)整合到煙草和加工番茄基因組中。關(guān)鍵詞：黃瓜花葉病毒，反向重復(fù)，轉(zhuǎn)基因植株，RN
