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《甘藍(lán)esrk重組體、突變體的構(gòu)建及其與scr相互作用單倍型的研究》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、西南大學(xué)博士學(xué)位論文甘藍(lán)eSRK重組體、突變體的構(gòu)建及其與SCR相互作用單倍型的研究姓名：韋靜宜申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：蔬菜學(xué)指導(dǎo)教師：王小佳20120604甘藍(lán)esRK重組體、突變體的構(gòu)建及其與scR相互作甭覃甭型的研究蔬菜學(xué)博士研究生韋靜宜指導(dǎo)教師王小佳摘要白交不親和(Scl仁iIlcompatibil妨，s：)是顯花植物在自然選擇下進(jìn)化出的反自交機(jī)制，而自交不親和信號傳導(dǎo)題耕究植物胞間信號傳導(dǎo)的模式系統(tǒng)。sI反應(yīng)在十字花科中表現(xiàn)為自我或自我相關(guān)的花粉在柱頭表面的萌發(fā)抑制。這個反應(yīng)是由發(fā)生在柱頭表面的受體-配體相互作
2、用所激發(fā)的。該受體是一種跨膜的絲氨酸／蘇氨酸受體激酶稱為S．位點(diǎn)受體激酶(S．10cusreceptorkinase，SRK)。SRK位于覆蓋整個柱頭表面的細(xì)胞膜乳突紐胞中。SIⅨ胞外域(eSRK)主要是負(fù)責(zé)配體結(jié)合，在單倍型間呈現(xiàn)高度多態(tài)性，是個S特異性決定因子。SRK配體被稱為S位點(diǎn)富含半胱氨酸(Sc)，ste逾e．rich，SCR)，或者SPll，位于富含脂質(zhì)的花粉壁中，是一個富含半胱氨酸的小分子蛋白質(zhì)。2001年＆曲roo等人的研究表明，SCR與SRK單倍型特異性結(jié)合導(dǎo)致自我花粉被拒絕。迄今為止，還沒有實(shí)驗(yàn)研究出
3、sRK的單倍型特異性的決定因素，生物信息學(xué)的預(yù)測為這一命題帶了各種各樣的假說。eSRK(SRK胞外域)負(fù)責(zé)配體結(jié)合，根據(jù)序列相似度可以將esRK分成三個子域。N．端類似于甘露糖結(jié)合凝集素(B．Le鰣onDomain)，中間的高變區(qū)包含了與單倍型特異性相關(guān)的大量變異，c．端是相似最高的PAN或APPLE域，參與蛋白質(zhì)一蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)．碳水化合物的相互作用。研究人員最感興趣的就是高變區(qū)，目前已確定有三個高變區(qū)(HVI的，HVII和HVIII)，這些區(qū)域被認(rèn)為是平衡選擇的產(chǎn)物。據(jù)推測，高變區(qū)中一些多態(tài)氨基酸是在自然選擇和植物理
4、化性質(zhì)發(fā)生改變的情況下獲得，這或許可以解釋新S單倍型是如何演變而來。序列分析表明，SCR就是結(jié)合在SRK高變區(qū)上。在育種實(shí)踐中，自交不親和系已經(jīng)成為重要育種材料，因此開展自交不親和性相關(guān)研究具有重要的理論價值和現(xiàn)實(shí)意義。為探索eSRK序列上參與配體結(jié)合及相互作用的區(qū)域，我們以結(jié)球甘藍(lán)高代自交系E、F為材料，構(gòu)建了3個甘藍(lán)不同單倍型的eSRK基因重組體，利用酵母雙雜交系統(tǒng)檢測各個重組體與SCR的相互作用。我們進(jìn)一步分析了SRK高變區(qū)上的多態(tài)性位點(diǎn)，篩選出9個多態(tài)性較高的位點(diǎn)，對其進(jìn)行突變，希望獲得在s砌osCR單倍型特異性
5、相互作用中起決定作用的氨基酸位點(diǎn)。l植物材料自交不親和性的分析為了鑒定本試驗(yàn)所使用的植物材料一結(jié)球甘藍(lán)材料E、F的自交不親和性，我們采用熒光顯微法觀察了兩種材料花期自交及雜交后花粉管萌發(fā)情況，并測定了二者花期自交和雜交的親和指數(shù)。結(jié)果顯示，結(jié)球甘藍(lán)材料E在花期自交時僅有少數(shù)(<10條)甚至沒有花粉管進(jìn)入柱頭，說明結(jié)球甘藍(lán)材料E具有自交不親和特性。同樣的，結(jié)球甘藍(lán)材料F在授上自身的花粉后，在柱頭中只能觀察到少數(shù)(<10條)進(jìn)入柱頭組織中的花粉管。結(jié)球甘藍(lán)材料E的花期自交親和指數(shù)為O．23，F(xiàn)花期自交親和指數(shù)為O．19，與多
6、年來的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)(未列出)相一致。通過熒光顯微可觀察到E、F花期相互雜交后柱頭中有大量(>25)的花粉管，二者花期正反交的親和指數(shù)均大于5。表明結(jié)球甘藍(lán)材料E、F為強(qiáng)自交不親和系，并且雜交親和。2甘藍(lán)材料舢和．譬C欠基因的克隆及分析針對P舒ⅨN端和C端相對保守的序列設(shè)計(jì)特異性引物eSRKs和eS砌7、守的半胱氨酸、B．1ecthl、S．10c鄴glycop以及PAN．APPLE區(qū)域等SRK胞外域絕大部分區(qū)域，除了信號肽。根據(jù)所獲得的單倍型信息設(shè)計(jì)了克?。驶虻囊铮㈨樌麖慕Y(jié)球甘藍(lán)材料E、F花蕾gDNA中擴(kuò)增出分別與e舒嗡、麟同源的SCR基因，命名為．妃‰和瓣。所獲得的溉基因編碼53個氨基酸，SC魅編碼61個氨基酸，兩段氨基酸序列均包含了SCR成熟肽的全部氨基酸序列，其中包含了在所有SCR氨基酸序列中高度保守的1個甘氨酸和8個半胱氨酸。3甘藍(lán)eSRK中決定其單倍型特異性的肽段的研究3．1酵母雙雜交系統(tǒng)檢測SCR與各
8、個eSRK間的相互作用為了探討HVI／II區(qū)域在SRK單倍型特異性及其與scR互作中的作用，本研究采用重組技術(shù)構(gòu)建甘藍(lán)不同單倍型叢砌@Z賦E與蚴基因間的重組體：P．S!R磁J、P．S!R磁2和e職‰，，用酵母雙雜交系統(tǒng)3檢測各eSRK重組體與SCR之間的相互作用。結(jié)果顯示，pGBKT7一SCRE×pGADT7-eS砌
