農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化研究

農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化研究

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1、河北農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化研究姓名:郝征申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別:博士專業(yè):果樹學(xué)指導(dǎo)教師:劉孟軍;趙錦20120531摘要棗樹(ZiziphusjujubaMill.)是我國(guó)原產(chǎn)重要果樹。棗樹由于花小、人工去雄難、坐果率低且胚敗育現(xiàn)象嚴(yán)重,使得其雜交育種非常困難。棗瘋病是由植原體引起致死性傳染病害,幾乎分布于國(guó)內(nèi)外所有棗區(qū),絕大多數(shù)棗樹品種都對(duì)其敏感,已成為制約棗產(chǎn)業(yè)發(fā)展的嚴(yán)重障礙。隨著生物技術(shù)的不斷發(fā)展,基因工程已成為現(xiàn)代植物改良育種的有效手段。本研究旨在探索建立農(nóng)桿菌介導(dǎo)的棗樹遺傳轉(zhuǎn)化體

2、系,并利用發(fā)根農(nóng)桿菌提高棗樹對(duì)棗瘋病的抗性,為棗樹遺傳改良和棗瘋病防治提供技術(shù)支撐。主要研究結(jié)果如下:1.建立了冬棗的花藥再生體系。誘導(dǎo)花藥愈傷的適宜培養(yǎng)基為1/2MS+I.0mg/L2,4.D+209/L麥芽糖+5.59/L瓊脂:花藥愈傷的適宜增殖培養(yǎng)基為MS+0.4mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+20∥L麥芽糖+5.59/L瓊脂;1.0lIl∥LTDZ和0.4mg/LNAA的組合是誘導(dǎo)冬棗花藥愈傷出芽的適宜生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合,誘導(dǎo)出芽率達(dá)100%,平均出芽數(shù)為3.9個(gè)/塊;0.2mg/LBA、0.

3、1mg/LIBA和1.5∥LPVA是玻璃苗恢復(fù)的適宜組合,玻璃苗恢復(fù)率為48.9%;在添加1.5mg/L認(rèn)A的生根培養(yǎng)基中,生根率最高(43.3%),根長(zhǎng)最長(zhǎng)(4.2cm)。2.首次建立了月光棗的花藥再生體系。誘導(dǎo)花藥愈傷的適宜培養(yǎng)基為1/2MS+I.0mg/L2,4一D+209/L麥芽糖+5.5∥L瓊脂;月光花藥愈傷的適宜增殖培養(yǎng)基為MS+0.6mg/LTDZ+0.1mg/LNAA+209/L麥芽糖+5.59/L瓊脂。適宜月光愈傷分化出芽的培養(yǎng)基為:MS+5.59/L瓊脂+209/L麥芽糖+0.8mg

4、/LTDZ+4.0mg/LAgN03。其誘導(dǎo)出芽率為100%,平均出芽數(shù)為10.4個(gè)/塊;在培養(yǎng)基MS+5.59/L瓊JJ旨+309/L蔗糖+0.2mg/LBA+0.1mg/LIBA+I.59/LPVA_中玻璃苗可恢復(fù)成正常苗;添加2.0mg/LIBA的生根培養(yǎng)基中月光生根率最高;GA3的添加對(duì)于棗愈傷的生長(zhǎng)和玻璃苗的恢復(fù)均為抑制作用。3.建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的冬棗葉片遺傳轉(zhuǎn)化體系。適宜的遺傳轉(zhuǎn)化條件為:根癌農(nóng)桿菌的OD600為O.8,侵染20min后,在共培養(yǎng)基MS+5.59/L瓊n旨+E09/L麥芽

5、糖+1.OmedLTDZ+0.1mg/LIBA+2009MAS(pn5.8)中暗培養(yǎng)3d。首次將雙抗蟲基因(Bt基因和蛋白抑制劑基因彳以)轉(zhuǎn)入冬棗中,得到了8個(gè)轉(zhuǎn)基因株系。4.建立了冬棗葉片及冬棗瘋組培苗的發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。冬棗葉片誘導(dǎo)毛根的適宜條件是在菌液濃度OD600為0.8時(shí)侵染葉片20min,在共培養(yǎng)基1/2MS+4.0medLIBA+5.5edL瓊脂+309/L蔗糖(pH5.8)中暗培養(yǎng)3.5d,然后轉(zhuǎn)接入培養(yǎng)基1/2MSo+CROlOoIIl∥L中,光照條件為光照/黑暗為14/1

6、0h。冬棗瘋組培苗莖段誘導(dǎo)出毛根的適宜條件為:在菌液中添加50I.tM的AS預(yù)活化l~2h,OD600為0.8侵染5~10rain,共培養(yǎng)5d,共培養(yǎng)基為MS+5.59/L瓊)l旨+209/L蔗糖+100mg/LCRO,光照條件為光照/黑暗為14/10h。首次通過(guò)發(fā)根農(nóng)桿菌侵染使冬棗瘋組培苗轉(zhuǎn)化為正常植株,得到了30個(gè)抗病性提高的轉(zhuǎn)健苗株系。關(guān)鍵詞:冬棗,瘋組培苗,遺傳轉(zhuǎn)化,房芒基因,蛋白抑制劑基因,根癌農(nóng)桿菌,發(fā)根農(nóng)桿菌,棗瘋病抗性Agrobacterium-mediatedtransformatio

7、nofChinesejujubeName:HaoZhengMajor.PomologySuperviser:.ProfessorLiuMengjunProfessorZhaoJinAbstractChinesejujube(ZiziphusjujubaMill.)isanimportantnativefruittreeofChina.ConventionalCTOOSisverydifficultinChinesejujubeforreasonsofverylowfruit-setting,veryhi

8、ghembryoabortionaswellasverysmallflower.Withthedevelopmentofbiotechnology,geneticengineeringhasbecomealleffectivemeansformodemplantbreedingimprovement.Thisstudyisaimedattoestablishingallgenetictransformationsystemandlaying

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