紅笛鯛重組激活基因克隆及表達分析

紅笛鯛重組激活基因克隆及表達分析

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1、廣東海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文紅笛鯛重組激活基因克隆及表達分析姓名:張雪利申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):水產(chǎn)養(yǎng)殖指導(dǎo)教師:魯義善201206紅笛鯛重組激活基因克隆及表達分析摘要重組激活基因(recombinationactivatinggenes,rag)是脊椎動物特異性免疫反應(yīng)的關(guān)鍵基因,是免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)和T細胞受體(Tcellreceptor,TCR)進行V(D)I基因重組過程中必不可少的一部分,是脊椎動物進化分析的標(biāo)記基因之一;該基因的表達能夠用來監(jiān)控淋巴細胞在免疫系統(tǒng)發(fā)育過程中

2、的出現(xiàn)以及定位,是淋巴細胞正常發(fā)育和成熟的必要因子。本論文以我國南方主要海水經(jīng)濟魚類之一一紅笛鯛(Lutjanussanguineus)為研究對象,應(yīng)用同源性克隆和RACE.PCR技術(shù)克隆了紅笛鯛ra91和ra92eDNA序列全長并對其進行了生物信息學(xué)分析。結(jié)果表明:ragl基因eDNA序列全長為3944bp,完整開放閱讀框(openreadingframe,ORF)為3183bp,5’非編碼區(qū)(5'-UTR)為200bp,3’非編碼區(qū)(3'-UTR)為561bp,編碼1060個氨基酸。預(yù)測分子量(MW)為

3、120.5kDa,理論等電點(pI)為8.72。ra92基因eDNA序列全長為2200bp,ORF為1602bp,5,-UTR為141bp,Y-UTR為457bp,編碼533個氨基酸。預(yù)測MW為59.6kDa,理論pI為5.42。BLAST分析顯示紅笛鯛ragl和ra92基因所編碼的氨基酸序列與其它已知物種相應(yīng)基因編碼的氨基酸序列最高同源性分別為82%和87%,多序列相似性比較表明RAGl和RAG2是高度保守的。構(gòu)建的系統(tǒng)進化樹分析顯示,紅笛鯛RAGl和RAGl分別與大西洋比目魚(Hippoglossush

4、ippoglossus)和紅鰭東方純(Takzfugurubripes)相應(yīng)蛋白的親緣關(guān)系較近。以GAPDH和p-actin基因為內(nèi)參,應(yīng)用Real.timePCR技術(shù),對滅活溶藻弧菌免疫前后,紅笛鯛ragl和ra92在胸腺、頭腎、脾臟、肝臟、心臟、肌肉、腸、腦等組織中的表達差異以及在上述組織中表達的時間差異進行了比較分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn),ragl和ra92的表達模式非常相似,在健康紅笛鯛體內(nèi),ragl和ra92主要在胸腺、頭腎和脾臟中表達,而經(jīng)滅活溶藻弧菌免疫48h后,ragl和ra92mRNA的表達量在所有組

5、織中都發(fā)生上調(diào)。在實驗時間段內(nèi),隨著免疫時間的延長,ragl和ra92mRNA的表達量在紅笛鯛不同組織中達到峰值的時間不同:48h時胸腺中表達量達到峰值,60h時頭腎、脾臟和腦中表達量均達到峰值,36h時肝臟中表達量達到峰值,而腸中則到96h時才達到峰值。將紅笛鯛ragl基因的一部分(編碼554個氨基酸)和ra92全基因序列(編碼533個氨基酸)分別亞克隆到原核表達載體pET.28a(+)中,構(gòu)建原核表達質(zhì)粒pET28.RAGl和pET28.RAG2,經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后它們在E.coliBL21(DE3)中獲

6、得了大量表達。優(yōu)化表達條件后,利用HisTrapTMHP親和層析柱純化了RAGl和RAG2融合蛋白。Westernblot分析發(fā)現(xiàn)RAGI和RAG2融合蛋白均可與鼠抗His.Tag單克隆抗體發(fā)生特異性結(jié)合,表明目的蛋白得以成功表達。利用純化的RAG2融合蛋白,按照常規(guī)方法免疫新西蘭大白兔,制備了兔抗RAG2多克隆抗體。ELISA檢測顯示,所獲得的抗血清效價達到1:40000,Westernblot顯示該血清能與RAG2融合蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。為進一步研究RAG2在紅笛鯛主要免疫器官的分布,應(yīng)用制備的多克

7、隆抗體對紅笛鯛胸腺、頭腎及脾臟組織進行了免疫組織化學(xué)分析。結(jié)果顯示,RAG2主要分布于上述器官的淋巴細胞中。關(guān)鍵詞:紅笛鯛,ra91和ra92,Real.TimePCR,原核表達,免疫組織化學(xué)IICloningandExpressionAnalysisofRecombinationActivatingGenesinRedSnapper,Lu咖nussanguineusAbstractRecombinationactivatinggenes(raglandra92),involvedintheV(D)Jrec

8、ombinationofimmunoglobulinandT-cellreceptorgenesplayacrucialroleintheadaptiveimmuneresponseinvertebrate.Alsotheycallbeusedasusefulmarkersinvolvedintheevolutionaryanalysisofthevertebrates.Theexpressionoftheseg

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