紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測狂犬病毒g抗體方法的建立及應(yīng)用

《紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測狂犬病毒g抗體方法的建立及應(yīng)用》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、廣西大學(xué)碩士學(xué)位論文紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測狂犬病毒G抗體方法的建立及應(yīng)用姓名：周松峰申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)指導(dǎo)教師：陸芹章；吳健敏20120630紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測狂犬病毒G抗體方法的建立及應(yīng)用摘要狂犬病是由狂犬病病毒(rabiesvirus，RV)引發(fā)的一種人獸共患傳染病，幾乎感染所有的溫血動物和人，能引起急性致死性腦脊髓炎，一旦發(fā)病，病死率幾乎100％，是迄今為止，病死率最高的急性傳染病，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生的重大疫病。目前，尚無有效的藥物和方法治療狂犬病，主要以免疫為主，免疫后能否產(chǎn)生有效的保護(hù)抗體，建立一種行之有效的狂犬病抗體檢測方法進(jìn)

2、行檢測十分重要，另外也可以通過抗體檢測進(jìn)行狂犬病診斷和疫苗評估。為構(gòu)建具有凝集性、免疫反應(yīng)性的雙功能融合蛋白，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)出兩對特異性引物，從重組質(zhì)粒pMD-G和pMD一2E8ScFv中分別擴(kuò)增出Kg基因和2E8基因，通過SOE-PCR方法法拼接成融合基因2E8Kg，進(jìn)一步構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET—Trx一2E8Kg，后轉(zhuǎn)入BL21(DE3)plysS中誘導(dǎo)表達(dá)。SDS—PAGE分析表明，2E8Kg融合基因獲得了高效表達(dá)并主要以包涵體形式存在，表達(dá)量占菌體總蛋白的23．5％左右，分子量約為77．7kD，與預(yù)期大小一致。將表達(dá)的蛋白以親和層析法進(jìn)行純化并通過谷胱

3、甘肽還原法進(jìn)行復(fù)性，純化后蛋白純度達(dá)到98．9％。經(jīng)Western—blot檢測和紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)證明，2E8Kg融合蛋白既能夠與狂犬病毒(Rv)高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，又能夠與人紅細(xì)胞結(jié)合，具有雙功能特性。以此雙功能融合蛋白為檢測抗原，以人‘0’型紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞，建立了快速檢測狂犬病毒G抗體的方法。通過方陣滴定試驗(yàn)篩選出檢測抗原最佳稀釋度為1：16，對應(yīng)的工作濃度為106．26lag／mL，血清最佳稀釋度為1：16，作用時間25min。利用該方法檢測犬細(xì)小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)陽性血清均無凝集，。與Rv標(biāo)準(zhǔn)陽性血清反應(yīng)出現(xiàn)強(qiáng)凝集，表明該方

4、法特異性強(qiáng)。用不同批次制備的檢測抗原重復(fù)檢測狂犬病毒陽、陰性標(biāo)準(zhǔn)血清，檢測結(jié)果完全一致，具有很好的重復(fù)性。將紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)與熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAvNT)作平行比對，通過對臨床1086份犬血清的檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血凝價大于或等于1：16(相當(dāng)于FAVNT試驗(yàn)中和效價O．5IU／mL)為免疫抗體合格，兩種檢測結(jié)果的符合率為89．2％。本研究利用雙功能融合蛋白建立的檢測犬狂犬病抗體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷方法，操作簡單、靈敏度高且特異性強(qiáng)，可以用于犬狂犬病抗體的檢測、疫苗免疫效果評估，滿足了基層快速、簡便、可現(xiàn)場使用的要求。關(guān)鍵詞：狂犬病毒抗人紅細(xì)胞單鏈抗體雙功能融

5、合蛋白紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)T恥DEVELoPM哐NTANDAPPLICATIoNoFERymoCYTEAGGLI刪A=noNASSA蜘FoRDETECTIoNoFTHEGANTmoDYToRABIESV刪SABSTRACTRabiesisazoonosiswhichsymptomsforacutefatalencephalomyelitiscausedbyrabiesvirus(rabiesvirus，RV)infectionofthecentralnervoussystemofwarm-bloodedanimalsandhuman,andalmostallwa

6、rm-bloodedanimalsareeasytobeinfected，Oncethediseasebreakout,itsmortalityrateisalmost100％，thatisoneofthehighesthumanfatalityrateofacuteinfectiousdiseases，ithasbecomethemajorepidemicsofseriousharmtopublichealth．Whilethereisnoeffectivemedicinefortreatingrabiesexceptformainlyfocusingo

7、npreexposureandpostexposureimmunization，SOtheeffectivediagnosisofpre—exposureandmonitoringwhethertheeffectiveprotectiveantibodyisproducedafterrabiesvaccinationornot，besidesdevelopingvaccineeffectivenessassessmentareveryInordertoconstructfusionproteinsthatc趾generateagglutinationand

8、immunereaction，specificprimerswer