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《紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)狂犬病毒g抗體方法建立及應(yīng)用》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)檢測(cè)狂犬病毒G抗體方法的建立及應(yīng)用摘要狂犬病是由狂犬病病毒(rabiesvirus，RV)引發(fā)的一種人獸共患傳染病，幾乎感染所有的溫血?jiǎng)游锖腿?，能引起急性致死性腦脊髓炎，一旦發(fā)病，病死率幾乎100％，是迄今為止，病死率最高的急性傳染病，已經(jīng)成為嚴(yán)重危害公共衛(wèi)生的重大疫病。目前，尚無(wú)有效的藥物和方法治療狂犬病，主要以免疫為主，免疫后能否產(chǎn)生有效的保護(hù)抗體，建立一種行之有效的狂犬病抗體檢測(cè)方法進(jìn)行檢測(cè)十分重要，另外也可以通過(guò)抗體檢測(cè)進(jìn)行狂犬病診斷和疫苗評(píng)估。為構(gòu)建具有凝集性、免疫反應(yīng)性的雙功能融合蛋白，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)出
2、兩對(duì)特異性引物，從重組質(zhì)粒pMD-G和pMD一2E8ScFv中分別擴(kuò)增出Kg基因和2E8基因，通過(guò)SOE-PCR方法法拼接成融合基因2E8Kg，進(jìn)一步構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET—Trx一2E8Kg，后轉(zhuǎn)入BL21(DE3)plysS中誘導(dǎo)表達(dá)。SDS—PAGE分析表明，2E8Kg融合基因獲得了高效表達(dá)并主要以包涵體形式存在，表達(dá)量占菌體總蛋白的23．5％左右，分子量約為77．7kD，與預(yù)期大小一致。將表達(dá)的蛋白以親和層析法進(jìn)行純化并通過(guò)谷胱甘肽還原法進(jìn)行復(fù)性，純化后蛋白純度達(dá)到98．9％。經(jīng)Western—blot檢測(cè)和紅細(xì)胞凝
3、集試驗(yàn)證明，2E8Kg融合蛋白既能夠與狂犬病毒(Rv)高免血清發(fā)生特異性反應(yīng)，又能夠與人紅細(xì)胞結(jié)合，具有雙功能特性。以此雙功能融合蛋白為檢測(cè)抗原，以人‘0’型紅細(xì)胞作為指示細(xì)胞，建立了快速檢測(cè)狂犬病毒G抗體的方法。通過(guò)方陣滴定試驗(yàn)篩選出檢測(cè)抗原最佳稀釋度為1：16，對(duì)應(yīng)的工作濃度為106．26lag／mL，血清最佳稀釋度為1：16，作用時(shí)間25min。利用該方法檢測(cè)犬細(xì)小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)陽(yáng)性血清均無(wú)凝集，。與Rv標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清反應(yīng)出現(xiàn)強(qiáng)凝集，表明該方法特異性強(qiáng)。用不同批次制備的檢測(cè)抗原重復(fù)檢測(cè)狂犬病毒陽(yáng)、陰
4、性標(biāo)準(zhǔn)血清，檢測(cè)結(jié)果完全一致，具有很好的重復(fù)性。將紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)與熒光抗體病毒中和試驗(yàn)(FAvNT)作平行比對(duì)，通過(guò)對(duì)臨床1086份犬血清的檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)血凝價(jià)大于或等于1：16(相當(dāng)于FAVNT試驗(yàn)中和效價(jià)O．5IU／mL)為免疫抗體合格，兩種檢測(cè)結(jié)果的符合率為89．2％。本研究利用雙功能融合蛋白建立的檢測(cè)犬狂犬病抗體紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)診斷方法，操作簡(jiǎn)單、靈敏度高且特異性強(qiáng)，可以用于犬狂犬病抗體的檢測(cè)、疫苗免疫效果評(píng)估，滿足了基層快速、簡(jiǎn)便、可現(xiàn)場(chǎng)使用的要求。關(guān)鍵詞：狂犬病毒抗人紅細(xì)胞單鏈抗體雙功能融合蛋白紅細(xì)胞凝集試驗(yàn)T恥D
5、EVELoPM哐NTANDAPPLICATIoNoFERymoCYTEAGGLI刪A=noNASSA蜘FoRDETECTIoNoFTHEGANTmoDYToRABIESV刪SABSTRACTRabiesisazoonosiswhichsymptomsforacutefatalencephalomyelitiscausedbyrabiesvirus(rabiesvirus，RV)infectionofthecentralnervoussystemofwarm-bloodedanimalsandhuman,andalmostal
6、lwarm-bloodedanimalsareeasytobeinfected，Oncethediseasebreakout,itsmortalityrateisalmost100％，thatisoneofthehighesthumanfatalityrateofacuteinfectiousdiseases，ithasbecomethemajorepidemicsofseriousharmtopublichealth．Whilethereisnoeffectivemedicinefortreatingrabiesexcep
7、tformainlyfocusingonpreexposureandpostexposureimmunization，SOtheeffectivediagnosisofpre—exposureandmonitoringwhethertheeffectiveprotectiveantibodyisproducedafterrabiesvaccinationornot，besidesdevelopingvaccineeffectivenessassessmentareveryInordertoconstructfusionpro
8、teinsthatc趾generateagglutinationandimmunereaction，specificprimerswereusedtoamplify，fromtherecombinantplasmidpMD—GandpMD一2ESScFvandwithPCR,2E8gene
