褐藻糖膠對(duì)小鼠乳腺癌的體內(nèi)外抵制作用及機(jī)制研究

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1、青島大學(xué)博士學(xué)位論文褐藻糖膠對(duì)小鼠乳腺癌的體內(nèi)外抵制作用及機(jī)制研究姓名：薛美蘭申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：博士專(zhuān)業(yè)：病原生物學(xué)指導(dǎo)教師：葛銀林20120529褐藻糖膠對(duì)小鼠乳腺癌的體內(nèi)外抑制作用及機(jī)制研究摘要背景與目的：褐藻糖膠(fucoidan)是從海帶中提取純化的一種多糖，其主要組成為褐藻糖、硫酸根，以及少量糖醛酸、半乳糖、木糖。褐藻糖膠具有抗腫瘤、抗病毒、抗凝血、降血脂、降血糖、增強(qiáng)免疫力等生物學(xué)功能，使之成為天然海洋藥物研究的熱點(diǎn)。研究證實(shí)，褐藻糖膠對(duì)腸癌、乳腺癌、肝癌和白血病等均有明顯的抑制作用，并能誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，而對(duì)正常細(xì)胞無(wú)毒副作用，但對(duì)其具體的作用機(jī)制尚未闡明。本研究以小鼠乳腺癌細(xì)

2、胞4T1為靶細(xì)胞，采用體外培養(yǎng)細(xì)胞(體外實(shí)驗(yàn))及建立荷瘤小鼠模型(體內(nèi)實(shí)驗(yàn))方法從分子水平、細(xì)胞水平及動(dòng)物整體水平探討褐藻糖膠的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制，為最終將該藥開(kāi)發(fā)成為一種新型的天然抗癌藥物奠定基礎(chǔ)。方法：1．體外實(shí)驗(yàn)：體外培養(yǎng)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1，采用MTT比色法、熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)(flowcytometry,FCM)、RT-PCR、．Westernblotting等方法，觀察不同濃度褐藻糖膠對(duì)4T1細(xì)胞增殖和凋亡的影響，探討褐藻糖膠體外的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制。2．體內(nèi)實(shí)驗(yàn)：培養(yǎng)4T1細(xì)胞接種Balb／e小鼠建立荷瘤小鼠模型，觀察褐藻糖膠對(duì)荷瘤小鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制情況，T

3、UNEL染色檢測(cè)瘤組織凋亡細(xì)胞，Westernblot及免疫組化等方法檢測(cè)褐藻糖膠處理后瘤組織內(nèi)Bel．2／Bax、生存素(Survivin)、B連環(huán)蛋白(B．eatinin)、細(xì)胞周期蛋白Cyclin．D1和細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶CDK4以及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)等相關(guān)蛋白的表達(dá)，探討褐藻糖膠體內(nèi)的抗腫瘤活性及其作用機(jī)制。結(jié)果：1．體外實(shí)驗(yàn)：褐藻糖膠(O、50、100、200I．tg／m1)作用4T1細(xì)胞48h后，在熒光顯微鏡下觀察到褐藻糖膠處理組細(xì)胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學(xué)改變：細(xì)胞核固縮、有DNA碎片；RT．PCI汲Westernblot結(jié)果顯示，隨褐藻糖膠濃度的增加，B

4、el．2mRNA和蛋白表達(dá)均下降、BaxmRNA和蛋白表達(dá)升高，導(dǎo)致Bcl．2／Bax比值下降；凋亡抑制蛋白Survivin表達(dá)增加；線(xiàn)粒體膜電位下降，細(xì)胞色素C由線(xiàn)粒體向細(xì)胞漿釋放增加，Caspase-3的活化率逐漸增加，明顯高于對(duì)照組(尸<0．05)：MTT比色結(jié)果顯示褐藻糖膠能抑帶JJ4T1細(xì)胞增殖；細(xì)胞周期分析表明，經(jīng)50、100、200I_tg／ml褐藻糖膠處理48h后，G1期4T1細(xì)胞數(shù)明顯增加，呈明顯的G1期阻滯；Westernblot結(jié)果顯示隨褐藻糖膠濃度增加，B-catinin、CyclinDl和細(xì)胞周期依賴(lài)激酶CDK4表達(dá)逐漸減少(P<0．05)。另外，褐藻糖膠處

5、理后，VEGF表達(dá)也出現(xiàn)減少(尸

6、nt通路中B．c撕nin、CyclinDl、CD瞄的表達(dá)和抑帛IJVEGF的生成有關(guān)。博士研究生薛美蘭(病原生物學(xué))皇指導(dǎo)教師葛銀林教授關(guān)鍵詞：褐藻糖膠；細(xì)胞凋亡；細(xì)胞周期阻滯；乳腺癌；荷瘤小鼠AntitumorEffectsofFucoidanandtheRelatedMechanisminVitroandinVivoAbstractBACKGRoUND&OBJECTIVE：Fucoidanisasulfatedpolysaccharidederivedfrombrownalgaethathasbeenreportedtoperformmultiplebiologicalactiv

7、ities，includingantitumoractivity．Fueoidancouldinhibitthegrowthoftumors，butthemechanismremainsunclear．Tllisstudyaimedtoexploretheantitumoreffectsandtherelatedmechanismoffucoidaninvitroandinvivowimmousebreastcancel．eellline4T1astarg