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1、華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文月月粉丁香酚合成酶基因RcEGS1的克隆及分析姓名：王海萍申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別：碩士專(zhuān)業(yè)：園林植物與觀賞園藝指導(dǎo)教師：唐開(kāi)學(xué)201206月月粉丁香酚合成酶基因RcEGSl的克隆及分析摘要丁香酚(Eugen01)是月月粉(Rosachinensis‘Pallida’)重要的花香成分之一，具有濃郁的丁香氣味。前人研究表明，丁香酚是以乙酸松柏酯(Coniferylacetate)為底物，由丁香酚合成酶催化形成的?？寺》治鲈录径∠惴雍铣擅富?，不僅有利于明確丁香酚合成酶基因在花香調(diào)控中的作用，而且為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)培育具有香味的月季品種提供候選基因。本文以
2、古老月季品種月月粉為材料，利用RT．PCR結(jié)合RACE—PCR技術(shù)，克隆了月月粉尺止GS，基因，并運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行了該基因在不同組織部位和不同開(kāi)放時(shí)期花瓣中的表達(dá)分析。將RcEGSl基因的完整編碼框通過(guò)酶切、連接轉(zhuǎn)到植物表達(dá)載體pBIA31中，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBIA31．RcEGSl，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤(pán)法成功轉(zhuǎn)化矮牽牛。本研究結(jié)果為進(jìn)一步對(duì)RcEGSl進(jìn)行功能驗(yàn)證和深入探討月季苯基丙烯類(lèi)物質(zhì)代謝路徑奠定基礎(chǔ)。具體研究結(jié)果如下：1．利用GenBank發(fā)表的丁香酚合成酶基因的氨基酸保守序列設(shè)計(jì)引物，用同源克隆法和RACE．PCR技術(shù)，從中國(guó)古老月季
3、月月粉盛開(kāi)期的花瓣中獲得了一個(gè)新的月季丁香酚合成酶基因，命名為RcEGSl，GenBank登錄號(hào)為JQ522949。該基因全長(zhǎng)為1171bp，開(kāi)放閱讀框(ORF)95lbp，編碼317個(gè)氨基酸，具有EGS基因的保守結(jié)構(gòu)域KQVDVVIS和KIIAAIK；其蛋白質(zhì)理論分子量為35．64kD，等電點(diǎn)為7．36。氨基酸同源序列比較發(fā)現(xiàn)，月季RcEGSl與矮牽牛PhlGSl的氨基酸保守區(qū)同源性最高，具有70％同源性，與羅勒ObEGSl同源性達(dá)59％，與月季RhEGSl的同源性為48％。2．運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法對(duì)月月粉6個(gè)不同發(fā)育時(shí)期的花朵和4個(gè)不同組織部位進(jìn)行分析，
4、發(fā)現(xiàn)RcEGSl基因在花瓣、萼片中有表達(dá)，在葉片、莖段中沒(méi)有表達(dá)，以花瓣中的表達(dá)量為最高，且在花蕾期沒(méi)有表達(dá)，在盛開(kāi)期的表達(dá)量最高，凋謝期表達(dá)量較低。即該基因的表達(dá)和月季花香物質(zhì)釋放量呈現(xiàn)一致的規(guī)律。3．用SmaI、Sail雙酶切質(zhì)粒pMDl8-RcEGSI和表達(dá)載體pBIA31，將回收的全長(zhǎng)基因片段和pBIA31大片段，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞Trans50t，對(duì)重組子茵液進(jìn)行PCR擴(kuò)增和雙酶切鑒定，電泳獲得預(yù)期約1000bp的條帶，說(shuō)明已成功構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBIA31-RcEGSl。華中農(nóng)業(yè)大學(xué)2012屆碩士研究生學(xué)位論文4．將構(gòu)建好的重組
5、質(zhì)粒轉(zhuǎn)化根瘤農(nóng)桿菌LBA4404感受態(tài)細(xì)胞，采用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化無(wú)菌矮牽牛的幼嫩葉片。經(jīng)過(guò)共培養(yǎng)和抗性篩選，提取再生植株的葉中DNA，進(jìn)行PCR檢測(cè)，初步證實(shí)得到7個(gè)陽(yáng)性再生植株。關(guān)鍵詞：月月粉；花香；丁香酚合成酶基因；實(shí)時(shí)定量PCR；表達(dá)載體構(gòu)建；轉(zhuǎn)化月月粉丁香酚合成酶基因RcEGSI的克隆及分析AbstractEugenolisanimportantfragrantcomponentinRosachinensis‘Pallida’，withs仃ongodorofclove．Itwasreposedthatconiferylalcoholservedasthesub
6、strateofEugenolsynthase(EGS)．TocloneandanalyzeeugenolsynthasegeneinR．chinensis‘Pallida’，cannotonlylayafoundationfortheresearchofsynthesispathwayofkeysynthasegenesinrose，andprovidecandidategenesforrose—scentbreeding．AneweugenolsynthasegenenamedRcEGSlwasclonedfromthepemlofRchinensis‘Pa
7、llida’byRT-PCRandRACE—PCR，theexpressionprofileofRcEGSlofRoseflowerwasanalyzedbyquantitativeRealTimePCRindifferenttissuesanddifferentdevelopmentalstages．AplantexpressionvectorpBIA31-RcEGSlwasconstructedbyinsertingtheOpenReadingFrame(ORF)ofRcEGSlbydigestionandligationandtransferredinto
8、petuniahybri
