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1、南方醫(yī)科大學(xué)2009級(jí)碩士學(xué)位論文血管抑素抑制兔角膜堿燒傷后新生血管的蛋白組研究Proteomicanalysisrevealseightcandidatesrespondingfor．●●一?！o●’ant卜anglogenesls0l=localadministrationolangnostatlnIortreatingalkaliinducedrabbitcornealneovascularization課題來(lái)源：廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目專業(yè)名稱學(xué)位申請(qǐng)人指導(dǎo)教師答辯委員會(huì)主席答辯委員會(huì)成員眼科學(xué)封亮旗劉?？∮趶?qiáng)陸曉和朱斯平吳京楊小紅論文評(píng)閱人郭?？脐悇?/p>
2、2012年04月15日廣州碩士學(xué)位論文血管抑素抑制兔角膜堿燒傷后新生血管的蛋白組研究碩士研究生：封亮旗指導(dǎo)老師：劉?？≌?．研究目的及意義角膜組織沒(méi)有血管的透明組織。維持其透明性的一個(gè)很重要的原因是它沒(méi)有血管。在感染、外傷、免疫反應(yīng)、排斥反應(yīng)、佩戴角膜接觸鏡、堿燒傷、基質(zhì)潰瘍、角膜緣干細(xì)胞病變等病理情況下，從角膜緣血管網(wǎng)形成的新生血管逐漸侵入角膜，從而形成角膜新生血管(cornealneovascularization，CNV)。誠(chéng)然，CNV在感染清除、傷口愈合等方面具有一定的積極作用。但是，CNV導(dǎo)致角膜的透明性降低，從而嚴(yán)重的影響視力，另外，CNV可破壞角膜
3、正常微環(huán)境，使眼前節(jié)生理性的免疫豁免消失，因而成為角膜移植排斥反應(yīng)的高危因素。因此，針對(duì)角膜新生血管的治療業(yè)已成為眼科的研究熱點(diǎn)。近年來(lái)的研究證實(shí)，血管抑素(angiostatin，AS)存在著明確的抗角膜新生血管形成的作用，角膜上皮細(xì)胞被證明可以分泌血管抑素，但在角膜受到損傷后分泌減少。另外，血管抑素被證實(shí)通過(guò)病毒載體或者局部運(yùn)用可以抑制角膜新生血管形成。但相關(guān)作用機(jī)制研究的不足，影響著其最終運(yùn)用于臨床的進(jìn)程。因此，闡明血管抑素抗角膜新生血管形成的機(jī)制，勢(shì)必為其臨床運(yùn)用奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，并產(chǎn)生巨大的社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益。2．研究方法眾所周知，蛋白質(zhì)是一類重要的生物大分子
4、，是生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者。摘要在蛋白質(zhì)組(proteome)概念提出以后，蛋白質(zhì)組學(xué)的研究取得了可喜的發(fā)展。相比較傳統(tǒng)的只針對(duì)單一蛋白質(zhì)的研究，蛋白質(zhì)組學(xué)更加注重的是參與特定生理或病理狀態(tài)的所有蛋白質(zhì)種類及其與周圍環(huán)境(分子)的關(guān)系。隨著相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展，目前已有可能對(duì)細(xì)胞在不同生理或病理?xiàng)l件下蛋白質(zhì)表達(dá)的異同，相關(guān)蛋白質(zhì)的分類和鑒定，尤其是蛋白質(zhì)之間相互作用和蛋白質(zhì)的功能進(jìn)行探討。因此，本課題擬以堿燒傷制備的角膜新生血管為基礎(chǔ)，局部施加血管抑素，將角膜組織進(jìn)行二維電泳，分離蛋白質(zhì)并進(jìn)行染色，凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)蛋白質(zhì)點(diǎn)進(jìn)行定量分析，從而明確局部施加血管抑素在抗角
5、膜新生血管形成過(guò)程中的差異表達(dá)蛋白，進(jìn)一步地，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)譜分析，從而得到相關(guān)蛋白質(zhì)的定性數(shù)據(jù)。3．研究?jī)?nèi)容和過(guò)程(1)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組：本實(shí)驗(yàn)采用的是32只新西蘭大白兔(購(gòu)自南方醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分為三組，A組為空白對(duì)照組：8只新西蘭兔不做任何處理；B組為燒傷組：12只新西蘭兔采用堿燒傷的方法建立角膜新生血管模型，術(shù)后第1天開(kāi)始局部生理鹽水點(diǎn)眼，每日3次，直至取角膜標(biāo)本；C組為治療組：12只新西蘭兔采用同樣方法建立角膜新生血管模型后，術(shù)后第1天開(kāi)始局部用3099／ml血管抑素(AS)點(diǎn)眼，每日3次，直至取角膜標(biāo)本。(2)角膜新生血管模型制作：堿燒傷法制備角
6、膜新生血管模型：氯胺酮25mg／kg及氯丙嗪25mg／kg肌注新西蘭兔全身麻醉，O．5％丁卡因表面麻醉，置開(kāi)瞼器充分暴露眼表，將浸有1．5mol／LNaOH液的10mm圓形濾紙片置于眼表中央，1．5min后取下，用50ml生理鹽水沖洗眼表，滴妥布霉素眼液后涂妥布霉素眼膏。(3)角膜新生血管的觀察：術(shù)后觀察角膜的新生血管，第16曰使用裂隙燈(蘇州66生產(chǎn)YZ5T型號(hào))照相。角膜新生血管的檢測(cè)：測(cè)量血管長(zhǎng)度，以連續(xù)彎曲度小、新生血管朝向角膜混濁中心生長(zhǎng)的最長(zhǎng)血管為準(zhǔn)，并計(jì)算角膜新生血管生長(zhǎng)面積(A)，按公式A=C／12x3．1416[1上．(r．1)2]。C為Nv累及
7、角膜的圓周鐘點(diǎn)數(shù)，l為新生血管從角膜緣深入角膜的長(zhǎng)度，r為兔角膜半徑，設(shè)為碩士學(xué)位論文定值7mm。(4)標(biāo)本取材及全蛋白提取：術(shù)后3w取材。標(biāo)本離體后迅速置入5ml凍存管，于液氮速凍后置入一80℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?。取?0℃保存的組織塊，迅速研磨至細(xì)粉末狀，加入裂解液勻漿、離心。采用Bradford定量法，計(jì)算樣品蛋白質(zhì)濃度。(6)雙向凝膠電泳(2．DE)：第一向(IPG．IEF)根據(jù)蛋白質(zhì)等電點(diǎn)的不同進(jìn)行等電聚焦，第二向(SDSPAGE)根據(jù)蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小分離樣品，雙向電泳后才用EMBL銀染。(7)圖像分析和差異蛋白選?。簩y染后的2-DE膠圖掃描入電
8、腦。應(yīng)用I
