豬FcγRI的可變剪接及其對PRRSV ADE效應(yīng)的調(diào)控作用

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1、⑩《次＃ＴＩＡＮＪＩＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹ中國第－所現(xiàn)代大學(xué)ＦＯＵＮＤＥＤＩＮ１８９５博士學(xué)位論文一生物學(xué)級學(xué)科：生物學(xué)：學(xué)科專業(yè)李藝：作者姓名指導(dǎo)教師：黃金海教授天津大學(xué)研究生院２０１７年５月豬FcγRI的可變剪接及其對PRRSVADE效應(yīng)的調(diào)控作用TheeffectsofalternativelysplicedporcineFcγRIonAntibody-dependentEnhancementofPRRSVinfection一級學(xué)科：生物學(xué)學(xué)科專業(yè)：生物學(xué)作者姓名：李藝指導(dǎo)教師：

2、黃金海教授天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院二零一七年五月中文摘要豬繁殖與呼吸綜合征俗稱“藍耳病”，是一種由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus,PRRSV）引起的高度接觸性傳染病，嚴重威脅全球養(yǎng)豬業(yè)發(fā)展。PRRSV具有抗體依賴性增強（Antibody-dependentenhancement,ADE）效應(yīng)，是造成持續(xù)性感染、免疫失敗及疫苗效果不佳的重要原因。FcγR是PRRSV靶細胞——豬肺泡巨噬細胞（Porcinealveolarmacrophages,PAM）上高表達的

3、膜受體，通過結(jié)合病毒-抗體免疫復(fù)合物（Immunecomplex,IC），介導(dǎo)病毒ADE效應(yīng)，并參與免疫細胞內(nèi)信號的調(diào)節(jié)及機體炎癥反應(yīng)。FcγR存在多種亞型，研究發(fā)現(xiàn)人和小鼠FcγR基因存在選擇性剪接，關(guān)于豬FcγRI的可變剪接及其參與PRRSVADE的機理尚不清楚。為了進一步明確FcγRI在PRRSVADE效應(yīng)中的作用，本文通過體外細胞感染模型，研究了FcγRI的可變剪接特征，膜型及可溶型FcγRI在介導(dǎo)細胞內(nèi)吞、抗原遞呈、致炎性作用中的功能，以及ADE特異性細胞應(yīng)答。這為理解FcγRI在PRRSVADE效應(yīng)中調(diào)控作用的分子機制和免疫應(yīng)答

4、特征，認識PRRSV獨特的致病及免疫機制提供了證據(jù)。主要結(jié)果如下：（1）豬FcγRI存在多種轉(zhuǎn)錄剪接體：從3頭豬PAM細胞中克隆到多種FcγRI轉(zhuǎn)錄剪接體，與豬基因組的GenomeScan分析表明，豬FcγRI基因通過3'端可變剪接產(chǎn)生至少6種剪接體，包括2種膜型和4種缺失跨膜區(qū)、潛在分泌型的可溶型FcγRI。對3頭豬個體的原代PAM細胞及傳代細胞3D4/21中FcγRI的125個克隆分析表明，不同F(xiàn)cγRI轉(zhuǎn)錄剪接體普遍表達于多種體內(nèi)原代細胞及3D4/21體外培養(yǎng)細胞系。單基因測序分析表明，PAM細胞上的FcγRI主要以膜型為主，約占轉(zhuǎn)錄

5、本的74%~91%，為優(yōu)勢轉(zhuǎn)錄本。（2）豬膜型FcγRI參與PRRSV-IC的內(nèi)化，介導(dǎo)PRRSVADE作用：將構(gòu)建的膜型、可溶型FcγRI真核表達載體，分別轉(zhuǎn)染PRRSV敏感細胞3D4/21及非敏感細胞293T，通過FcγRI抗體阻斷實驗、病毒載量測定、confocal觀察網(wǎng)格蛋白變化等，比較了PRRSVADE效應(yīng)下的細胞應(yīng)答，研究了膜型、可溶型FcγRI在PRRSVADE中的作用。利用相對熒光定量PCR、confocal方法發(fā)現(xiàn)，過表達膜型FcγRI（pcDNA3.1-T1）可增強PRRSV-IC對3D4/21和293T細胞的感染，而可

6、溶型FcγRI（pcDNA3.1-T3）不具備介導(dǎo)PRRSVADE的能力。Confocal結(jié)果表明，膜型FcγRI通過增強網(wǎng)格蛋白的表達及募集，促進成熟溶酶體的形成及轉(zhuǎn)運，介導(dǎo)病毒內(nèi)化。Real-timePCR結(jié)果表明，高豐度的可溶型FcγRI轉(zhuǎn)錄表I達，可上調(diào)PRRSVADE感染中IFN-β、TNF-α、IL-1β炎性因子及抗原遞呈分子MHC-I、II表達，促進細胞的炎性反應(yīng)，負向調(diào)控PRRSVADE效應(yīng)。而膜型FcγRI的高表達，抑制了TLR7，下調(diào)了干擾素的產(chǎn)生。（3）PRRSV上調(diào)細胞中可溶型FcγRI比率，ADE作用抑制機體抗病毒

7、反應(yīng)，影響靶細胞應(yīng)答，增強FcγR介導(dǎo)的內(nèi)吞，抑制炎性因子轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)特異性TCRVβ細胞亞群增殖。研究了有、無PRRSV特異性抗體下PRRSV感染3D4/21細胞，幾種FcγR的轉(zhuǎn)錄變化，Real-timePCR顯示PRRSV僅上調(diào)了FcγRI的轉(zhuǎn)錄，而PRRSV通過特異性抗體介導(dǎo)的ADE感染時，F(xiàn)cγRIIB轉(zhuǎn)錄提高4倍且FcγRI被抑制。利用單基因-高分辨率熔解曲線（SGA-HRM）發(fā)現(xiàn)，受PRRSV影響顯著上調(diào)的FcγRI主要為可溶型FcγRI，比例由19.5%（感染前）升至33.3%（感染后）。轉(zhuǎn)錄組分析數(shù)據(jù)也表明，ADE顯著提高了

8、FcγR介導(dǎo)的內(nèi)吞，增強FcγRIIB的轉(zhuǎn)錄，影響細胞表面FcγR的平衡，抑制抗病毒免疫應(yīng)答。經(jīng)轉(zhuǎn)錄組分析及RT-PCR驗證，ADE作用抑制TLR7、RIG-I/MDA5，降低I