α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定方法

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1、2.2實驗方法2.2.1α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定方法2.2.1.1反應溶液的制備(1)配制底物PNPG溶液:精確稱取0.3766gPNPG,加適量0.1mol/L磷酸緩沖液(pH為6.8)溶解,再用容量瓶準確定容到50mL,配制成25mmol/L的母液。將母液分別稀釋成0.1、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mmol/L7個不同梯度的標準品溶液,備用。(2)配制α-葡萄糖苷酶的酶溶液:將凍干酶粉(酶活力為14u/mg)用0.01mol/L磷酸緩沖液(pH為6.8)溶解,配制成2u/mL的母液。再將酶液分別稀釋,配制成0.

2、1、0.2、0.3、0.4、0.5、1.0u/mL的酶溶液,備用。(3)配制DNJ標準溶液(抑制劑):精確稱取0.0010gDNJ標準品,用容量瓶準確定容到10mL,配制成1000μg/mLDNJ標準母液。將母液分別稀釋成、1、5、10、20、40、60μg/mL六個不同梯度的標準品溶液,備用。(6)0.2mol/L的Na2CO3:稱取2.16gNa2CO3于燒杯中,加入適量蒸餾水溶解,并定容到100mL,4℃下保存,備用。2.2.1.2PNP標準曲線的繪制精確稱取0.0278g對硝基酚(PNP),加0.01mol/L磷酸緩沖液(pH為6

3、.8)溶解,再用容量瓶定容至10mL,即得20mmol/L母液。用蒸餾水將其母液稀釋成濃度分別為1、5、10、20、40、40、80和100μmol/L的標準溶液。取100μl上述標準液,各加入150μL0.2mol/L的Na2CO3,混勻1min,再于405nm處測定其吸光度,得標準曲線方程:y=128.13x+0.3579(R2=0.9998),其中y為濃度,x為吸光值。2.2.1.3α-葡萄糖苷酶抑制活性的測定測定方法參照MasaoHattori等試驗條件,并做調(diào)整。實驗分為空白組、對照組、樣品空白組和樣品組,各反應物按表中劑量在9

4、6孔板中進行加樣,每組3個平行。按表依次加入PBS緩沖液、抑制劑溶液和底物,混合均勻,于37℃水浴保溫10min,結束后,取出,加入37℃水浴的酶溶液,充分混勻,于37℃水浴反應20min,結束后加入150μL0.2mol/L的Na2CO3溶液中止反應。由于PNPG在α-葡萄糖苷酶的作用下能水解產(chǎn)生葡萄糖和PNP,PNP在405nm處有最大吸收,其測定其吸光度,根據(jù)公式便可計算出各樣品α-葡萄糖苷酶的抑制率及IC50值。3公式表4各反應物添加計量和順序(單位:μL)Table4Therespectivereactantsaddmeasur

5、ementandsequence(Unit:μL)試劑空白組對照組樣品空白組樣品組PBS溶液80706050抑制劑002020PNPG底物20202020充分混勻,37℃下孵化10min酶溶液010010充分混勻,37℃下反應20min碳酸鈉1501501501502.2.2單因素試驗設計以底物濃度、酶濃度、酶促反應時間和添加順序為考察因素,以DNJ的α-葡萄糖苷酶抑制率為衡量指標,進行單因素試驗。固定反應順序為抑制劑+酶再加底物、底物濃度為2.0mmol/L,酶濃度0.3u/mL,緩沖液pH為6.80,反應時間為20min。2.2.2.

6、1反應物添加順序分別考察如下三種不同的反應順序?qū)σ种苹钚缘挠绊?。a、抑制劑+底物→37℃溫育10min→+酶,反應20min→碳酸鈉終止反應→測定b、抑制劑+酶→37℃溫育10min→+底物,反應20min→碳酸鈉終止反應→測定c、底物+酶→37℃溫育10min→+抑制劑,反應20min→碳酸鈉終止反應→測定2.2.2.2底物濃度選DNJ和拜唐蘋為抑制劑,以其α-葡萄糖苷酶抑制率為指標,考察0.5、1.0、2.0、4.0、5.0mmol/L這5個不同梯度的底物對抑制活性的影響。2.2.2.3酶濃度選DNJ和拜唐蘋為抑制劑,以其α-葡萄糖苷

7、酶抑制率為指標,考察0.1、0.3、0.5、0.7、0.9u/mL5個不同濃度的酶對抑制活性的影響。2.2.2.4緩沖液pH選DNJ和拜唐蘋為抑制劑,以其α-葡萄糖苷酶抑制率為指標,分別考察不同pH6.6、6.8、7.0、7.2和7.4的緩沖液對抑制活性的影響。32.2.2.5反應時間選DNJ和拜唐蘋為抑制劑,以其α-葡萄糖苷酶抑制率為指標,考察10、20、30、40和50min不同反應時間對抑制活性的影響。參考文獻[1]MaCM,HattoriM,DaneshtalabM,etal.Chlorogenicacidderivativesw

8、ithalkylchainsofdifferentlengthsandorientations:potentalpha-glucosidaseinhibitors[J].JMedChem,20

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