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《硫胺素缺乏對β-淀粉樣多肽前體蛋白加工和aβ生成的作用及機制研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、復旦大學博士學位論文硫胺素缺乏對β－淀粉樣多肽前體蛋白加工和Aβ生成的作用及機制研究姓名：張騎鵬申請學位級別：博士專業(yè)：神經(jīng)生物學指導教師：孫安陽20080930中文摘要一、中文摘要硫胺素缺乏對13-淀粉樣多肽前體蛋白加工的調(diào)節(jié)阿爾茨海默病(Alzheimerdisease，AD)是老年癡呆的最常見類型，其神經(jīng)病理學特征主要表現(xiàn)為沉積在細胞外的老年斑(Senileplaques，SPs)和細胞內(nèi)聚集的神經(jīng)纖維纏結(Neurofibrillarytangles，NFTs)以及區(qū)域性的神經(jīng)元喪失。目前，對于AD的發(fā)病原因及其病理機制了解甚少，尚沒有有效的治療方
2、法。p淀粉樣多肽(13-Amyloidpeptide，Ap)是SPs的主要成分，來源于p淀粉樣多肽前體蛋白(Amyloidprecursorprotein，APP)的蛋白剪切。大量研究表明A13的代謝異?？赡苁茿D起始性的病理環(huán)節(jié)。研究AB的代謝對于探討AD的發(fā)病機理較為重要。硫胺素(Thiamine)即維生素Bl，是人體必需的營養(yǎng)成分。硫胺素在體內(nèi)主要以焦磷酸硫胺素(Thiaminepyrophosphate，TPP)的形式存在，TPP是糖代謝途徑中的丙酮酸脫氫酶復合體，a．酮戊二酸脫氫酶復合體以及磷酸戊糖途徑中的轉酮醇的輔酶因子。硫胺素在維持腦內(nèi)氧化代
3、謝平衡方面也發(fā)揮了重要作用。硫胺素缺乏(Thiaminedeficiency，TD)會導致以上三種酶類的活性下降、三羧酸循環(huán)發(fā)生障礙、三磷酸腺苷(adenosine．triphosphate，ATP)產(chǎn)生受阻。此外，硫胺素缺乏過程中產(chǎn)生了大量的活性氧(reactiveoxygenspecies，ROS)，導致了氧化應激的發(fā)生。主要依靠糖代謝提供能量的神經(jīng)組織對硫胺素缺乏高度敏感，硫胺素缺乏的中樞神經(jīng)表現(xiàn)稱為腦型維生素Bl缺乏癥，也稱韋尼克一科爾薩科夫綜合癥(Wemicke．Korsakoff'ssyndrome，WKS)，病人除了有明顯的認知喪失、記憶力減
4、退外，晚期WKS病人出現(xiàn)腦室擴大，神經(jīng)元死亡。其腦內(nèi)的KGDHC活性也明顯降低。在硫胺素缺乏動物模型上，硫胺素缺乏處理的小鼠腦內(nèi)出現(xiàn)了神經(jīng)元死亡，小膠質細胞、星型膠質細胞肥大、增生等神經(jīng)退行性疾病的共同病理表現(xiàn)。此外，研究顯示，在AD病人中，TPP含量和TPP依賴型的酶類的活性都有明顯的下降，表明硫胺素缺乏可能在AD病理中起了一定的作用。但硫胺素缺乏在AD中的具體作用尚未得到系統(tǒng)的研究。我們在體外培養(yǎng)的穩(wěn)定轉染了瑞典型突變APP基因(APPsw)的人源神經(jīng)母細胞瘤細胞株(SH．SY5Y)上和C57BL／6J小鼠上成功誘導了TD模型，并通過酶連免疫吸附實驗、
5、免疫印跡實驗、免疫組織化學等技術手段系統(tǒng)地研究了TD對APP加工(APPprocessing)的影響以及其可能的機制。首先，在APPswSH．SY5Y細胞上，TD處理5天導致了大約13．5％的細胞死亡，發(fā)生凋亡的細胞增加了2倍。MTT法檢測表明TD處理5天導致細胞活3中文摘要力下降了大約50％。第二，酶連免疫吸附實驗測定A13的結果顯示：TD處理顯著增加細胞外和細胞內(nèi)的913的含量。與對照組(胞外的Afl40和A陸分別是5．52_+0．12和0．66±0．23pg／m1．rag)相比，TD5天組胞外的A‰和A險分別上升到18．57+2．31和3．85+0．
6、52pg／m1．mg；細胞內(nèi)的A‰和A[342分別從對照組的23．4±5．17和7．06±1．03pg／mg分別上升到86．0318．19和23．52±1．02pg／mg。第三，免疫印跡實驗顯示在TD過程中，細胞中成熟形式的APP蛋白水平降低，不成熟形式的APP蛋白水平?jīng)]有明顯變化。說明在TD過程中APP的表達水平?jīng)]有增加，應該不是導致AB積累的原因。第四，酶活力測定的結果表明負責APP加工的p分泌酶的活性在TD過程中明顯增高，而丫．分泌酶的活性在這一過程中沒有顯著性變化。前人研究結果證實13-siteAPPcleavingenzymel(BACEl)具有
7、肛分泌酶的活性，我們分別從轉錄以及翻譯水平研究了BACEI基因的表達情況，發(fā)現(xiàn)在TD處理過程中，BACEl基因的mRNA水平?jīng)]有明顯變化，BACEI的蛋白總量也沒有明顯改變。然而，與對照組相比，BACEl蛋白的成熟形式增加了大約2倍，而不成熟形式的BACEl降低了大約50％。表明p分泌酶的活性調(diào)節(jié)不是通過增加BACEl基因的轉錄水平或翻譯水平，而是通過促進BACEl蛋白的翻譯后修飾(BACEl蛋白的成熟過程)來實現(xiàn)的。為了進一步確定p分泌酶的活性在TD過程中明顯增高，我們檢測了TD過程中p分泌酶產(chǎn)物：pCterminalfragment(p．CTF)的變化
8、，免疫印跡結果顯示13-CTF含量在TD過程中明顯增高。第五，TD
