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1、分類號(hào)：密級(jí)：無(wú)UDC：?jiǎn)挝淮a：10118山西師范大學(xué)研究生碩士學(xué)位論文cadR的葉綠體靶向表達(dá)及其對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥鎘抗性的影響李靖銳指導(dǎo)教師魏學(xué)智教授山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別理學(xué)碩士專業(yè)名稱生物學(xué)論文提交日期年月日論文答辯日期年月日學(xué)位授予單位山西師范大學(xué)學(xué)位授予日期年月日答辯委員會(huì)主席評(píng)閱人2016年月日萬(wàn)方數(shù)據(jù)萬(wàn)方數(shù)據(jù)摘要論文題目：cadR的葉綠體靶向表達(dá)及其對(duì)轉(zhuǎn)基因擬南芥鎘抗性的影響專業(yè)：生物學(xué)碩士生：李靖銳簽名：指導(dǎo)教師：魏學(xué)智簽名：摘要目前重金屬污染日益嚴(yán)重已經(jīng)成為全球性關(guān)注問(wèn)題。巖石裸露、火山爆發(fā)等地質(zhì)成因以及燃料燃燒、工業(yè)排放、汽車尾氣、污水排放等人類活動(dòng)使
2、重金屬釋放到環(huán)境中。鎘廣泛分布在環(huán)境中，在20種危險(xiǎn)物中排名第七。由于重金屬鎘很難降解且具有相對(duì)移動(dòng)性，排放到陸地和海洋生態(tài)系統(tǒng)中的鎘可以通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體，對(duì)人類的生命安全造成威脅。對(duì)于大多數(shù)生物來(lái)說(shuō)，長(zhǎng)期暴露于高鎘環(huán)境中會(huì)產(chǎn)生致癌、誘變、致畸等嚴(yán)重后果。最近有相關(guān)報(bào)道說(shuō)鎘可以誘發(fā)人類肺腺癌上皮細(xì)胞發(fā)生早期炎癥反應(yīng)。鎘在植物體內(nèi)積累可影響植物的光合作用、呼吸作用、氣體交換、營(yíng)養(yǎng)運(yùn)輸、抗氧化系統(tǒng)等，從而造成植物葉片皺縮失綠，根部褐化，生長(zhǎng)停滯，最后使植物凋亡。葉綠體是鎘敏感的細(xì)胞器之一。在鎘脅迫下，葉綠體結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生很大的改變，葉綠體中的分子和新陳代謝也會(huì)受到嚴(yán)重影響。例如在鎘的影響下，
3、光合作用、電子傳遞鏈以及參與光合作用的酶都會(huì)受到傷害，從而產(chǎn)生活性氧反應(yīng)（ROS）。在藻類植物中，鎘可以抑制光合系統(tǒng)II（PSII）的光活化，產(chǎn)生光合速率、呼吸速率降低等不良反應(yīng)。因此在植物葉綠體中超表達(dá)金屬結(jié)合蛋白來(lái)降低金屬毒性隨之增強(qiáng)植物抗性是解決重金屬對(duì)植物傷害的有效方法之一。典型的原核生物攜帶一系列金屬調(diào)控蛋白，它們可以直接與金屬結(jié)合從而保持金屬離子的平衡。這些金屬調(diào)控蛋白可以有選擇性的應(yīng)答一種或一小組相互關(guān)聯(lián)的金屬。MerR家族是原核生物中一類主要的金屬調(diào)控蛋白，CadR是其中的一員，可以感應(yīng)Cd，對(duì)細(xì)菌Cd解毒過(guò)程有重要作用。cadR編碼147個(gè)氨基酸，含有三個(gè)保守的金屬結(jié)
4、合位點(diǎn)（Cys77,Cys112,Cys119），N端含有螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋的結(jié)構(gòu)，C端有一段富組氨酸序列，可能與其特異結(jié)合鎘有關(guān)。為了減少鎘對(duì)葉綠體的傷害，運(yùn)用分子生物學(xué)手段將金屬結(jié)合蛋白特異表達(dá)在葉綠體中，通過(guò)改良葉綠體對(duì)鎘的耐受和積累來(lái)提高整個(gè)植株的抗性以及鎘的積累。cadR是惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）中調(diào)控基因特異與Cd結(jié)合的調(diào)控因子，對(duì)降低鎘對(duì)細(xì)菌的毒害起著重要作用。為了證明Cd特異的cadR可以提高植物的Cd積累和Cd抗性，本研究中將來(lái)源于惡臭假單胞菌（Pseudomonasputida）cadR異源表達(dá)在植物中。將cadR表達(dá)在模式植物擬南芥的細(xì)胞質(zhì)
5、中或葉綠體中。I萬(wàn)方數(shù)據(jù)山西師范大學(xué)學(xué)位論文比較細(xì)胞質(zhì)和葉綠體定位的CadR轉(zhuǎn)基因擬南芥的Cd積累和Cd抗性。我們發(fā)現(xiàn)葉綠體定位的CadR轉(zhuǎn)基因擬南芥可以積累更多的Cd并且Cd抗性更強(qiáng)。更重要的是，CadR轉(zhuǎn)基因擬南芥專一抗Cd,對(duì)其他二價(jià)金屬離子幾乎不抗。主要結(jié)果如下：（1）cadR轉(zhuǎn)基因擬南芥的亞細(xì)胞定位及葉綠體靶向表達(dá)我們?cè)贑adR上游連接了一個(gè)轉(zhuǎn)運(yùn)肽，使其定位在擬南芥質(zhì)體中，并用CAB2啟動(dòng)子使CadR特異在地上部分表達(dá)。用激光共聚焦顯微鏡觀察CadR的亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，p35S::cadR-GFP（細(xì)胞質(zhì)定位）和p35S::TP-cadR-GFP（質(zhì)體定位）的地上和地下部分都能
6、看到熒光，而pCAB2::TP-cadR-GFP（葉綠體定位）只能在地上部分的葉綠體中看到熒光。（2）CadR的表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因擬南芥的鎘抗性在鎘脅迫下，cadR轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)大于野生型。例如，在25μMCd下，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的根長(zhǎng)平均增加了54%。在25、50、100μMCd下，轉(zhuǎn)基因擬南芥與野生型的鮮重?zé)o差異，但在75μMCd下，與野生型擬南芥相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥的鮮重增加了27%–57%。（3）cadR轉(zhuǎn)基因擬南芥的Cd積累增加Cd處理2天后，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥根中的Cd含量顯著增加（最高達(dá)到2倍）。Cd處理7天后，轉(zhuǎn)基因擬南芥和野生型的根和葉中的Cd
7、含量均增加，并無(wú)差異。Cd處理16天后，與野生型相比，轉(zhuǎn)基因擬南芥根和葉中的Cd含量均顯著增加。我們也測(cè)定了單株擬南芥根和地上部分中Cd含量。7天和16天Cd處理下，轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部分和根中的Cd含量顯著高于野生型（地上部分高達(dá)3.5倍，根中高達(dá)5.1倍）。（4）轉(zhuǎn)基因擬南芥中Cd對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素積累的影響16天Cd處理后，定量分析野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥中的大量元素（Ca、K、P、S、Na、Mg）和微量元素（Mn、Zn、Cu、Fe）。我們發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因
