擬南芥vkor基因缺損對抗逆基因annat1表達(dá)影響

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1、擬南芥VKOR基因缺損對抗逆基因AnnAT1表達(dá)影響1前言1.1鹽脅迫鹽脅迫是由滲透脅迫和離子脅迫組成的，在鹽脅迫條件下，植物的外部形態(tài)和內(nèi)環(huán)境的生理特性都發(fā)生了一系列的變化，鹽脅迫傷害引起的變化有一些是植物對逆境條件的消極反應(yīng)，有些變化引起了植物對逆境的積極反應(yīng)，有利于對逆境環(huán)境條件的適應(yīng)（許祥明等，2000）。鹽脅迫是指土壤中可溶性鹽類含量過高而對植物的正常生長與發(fā)育所造成的不利影響（ParidaandDas,2005）。鹽土、鹽化土、堿土以及堿化土壤統(tǒng)稱為鹽堿土，又被稱為鹽漬土壤。鹽化土壤一般含有多種鈉鹽，Na+鹽分對植物個體形態(tài)發(fā)育具有顯著的影響，其表現(xiàn)就是鹽

2、脅迫抑制了植物組織和器官的生長，加速了發(fā)育進(jìn)程，縮短了營養(yǎng)生長期和開花期，使禾本科植物的分蘗數(shù)和籽粒數(shù)減少等。植物長時間的鹽脅迫會造成葉片的面積變?。∕unnsetal.1988），這可能是由于鹽分降低了細(xì)胞的分裂或是降低了細(xì)胞延伸的速率。鹽脅迫抑制在懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的細(xì)胞分裂的實驗現(xiàn)象極為明顯，Bernstain等以高粱葉片為材料進(jìn)行了鹽脅迫處理，觀測到葉片的生長區(qū)比正常條件下變小是這種土壤最主要的一種有害離子，氯化鈉和硫酸鈉含量較多的土壤被稱為鹽土；含較多碳酸鈉和碳酸氫鈉的土壤，被稱為堿土。土壤中往往會同時存在上述兩種土壤，因此稱其為鹽堿土（張其德，1999）。鹽脅迫

3、主要包括滲透脅迫和離子脅迫還有它引起的次級脅迫（ShinozakiandYamaguchi-Shinozaki,1997），這些脅迫嚴(yán)重破壞了植物體內(nèi)細(xì)胞的植株水平上的內(nèi)環(huán)境水分子和離子穩(wěn)態(tài)平衡，導(dǎo)致了植物細(xì)胞分子破裂，植株生長減緩乃至死亡（Greenetal.,1998）。一部分研究者認(rèn)為這很可能與細(xì)胞壁的硬化（指不可逆伸展能力，即伸展性）有密切關(guān)系。在干旱條件下細(xì)胞壁的硬化有效地縮小了植物葉面積，因而也就顯著地阻止了植株的蒸騰失水，增強了植株的生存能力。干旱脅迫下植物的生物量分配也發(fā)生明顯變化。水分缺失條件下植物生物量向根部的分配增加，功能根變多，并且長度也會增加

4、。不同品種的植物耐旱性也不同，在干旱脅迫下的反應(yīng)也不同，抗旱的楊樹無性系在干旱的初期階段可以將更多的物質(zhì)優(yōu)先向根和莖運輸，而對干旱敏感的植株無性系在水分缺失的條件下缺乏這種分配的可塑性（Timothyeta1.,1998）。調(diào)整氣孔開合的程度來阻止植物體內(nèi)水分的快速散失以及維持一定的光合作用是植物對水分缺失脅迫的初始反應(yīng)。氣孔反應(yīng)有2種方式：一種叫第一線防御，又被稱為預(yù)警系統(tǒng)，它能按照空氣濕度的大小作出直接的反應(yīng)。當(dāng)空氣濕度降低時，保衛(wèi)細(xì)胞和附近的表皮細(xì)胞直接蒸發(fā)水分，引起氣孔迅速關(guān)閉，此時葉子等其他部位并沒有水分虧缺的狀況，所以它可以防止整片葉子發(fā)生水分虧缺，降低了

5、干旱對植物產(chǎn)生的傷害。另一種叫第二線防御，它是針對葉子已經(jīng)發(fā)生了水勢變化的應(yīng)對。當(dāng)葉子水勢降至一定程度時，引起氣孔關(guān)閉，這樣就會使水分散失量減少，同時也有助于葉子恢復(fù)本來的水勢。等到葉子水勢恢復(fù)成功，則氣孔就會再次開放。2材料與方法2.1實驗材料擬南芥（Arabidopsisthaliana,Col）的種子為本實驗室保存；突變體材料購自ArabidopsisBiologicalResourceCenter，為本實驗室保存；培養(yǎng)條件，長日照為16h光照/8h黑暗，22C；短日照為8h光照/16h黑暗，22C。本研究所用的大腸桿菌菌株為DHB4和BL21，由本實驗室保存；

6、原核表達(dá)載體pET30a為本實驗室保存。EasyTaqDNA聚合酶、EasyPfuDNA聚合酶從北京全式金生物技術(shù)（TransGenBiotech）有限公司購得；T4DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI從大連TaKaRa公司購得。dNTP、DL2000DNAMarker、DL2000PlusDNAMarker、DL2000PlusIIDNAMarker從北京全式金生物技術(shù)（TransGenBiotech）有限公司購得；低分子量蛋白Marker購于TaKaRa公司；質(zhì)粒小量快速提取試劑盒從生工生物工程（上海）有限公司購得；IPTG購于上海生物工程公司；HisT

7、rapHP蛋白純化柱購自GE公司；碘乙酰胺、考馬斯亮藍(lán)（G-250）為Sigma進(jìn)口分裝產(chǎn)品；小分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白、咪唑從普天公司購得；其他的藥品和試劑如NaCl、MgCl2、CaCl2、NaOH均為國產(chǎn)分析純試劑。2.2主要試劑的配制（1）1mol/LTris-HCl（pH8.0）：稱取12.11gTris，加入約80mL去離子水，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH，待溶液冷卻至室溫后調(diào)準(zhǔn)pH至8.0，定容至100mL，高壓滅菌，室溫保存；（2）0.5mol/LEDTA（pH8.0）：稱取18.61gEDTA，加入約80mL去離子水，溶解后用NaOH調(diào)pH至8.0，定容