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《探討腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因tmsg-1蛋白轉(zhuǎn)錄新功能》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、探討腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因TMSG-1蛋白轉(zhuǎn)錄新功能摘要目的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因TMSG一1的腫瘤轉(zhuǎn)移抑制和神經(jīng)酰胺合成功能方面已經(jīng)做過大量研究，但其轉(zhuǎn)錄功能研究甚少。本研究通過構(gòu)建含有TMSG．1蛋白不同功能域的真核重組質(zhì)粒并觀察各重組質(zhì)粒在亞細(xì)胞的定位，以確定基因內(nèi)部的核定位信號，探索TMSG．1蛋白作為轉(zhuǎn)錄因子的新功能。方法以TMSG．1真核表達(dá)載體為模板，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增TMSG一1基因全長和不同截斷體片段，與帶有Flag標(biāo)簽的真核表達(dá)載體pcDNA3連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5a，經(jīng)氨芐青霉素篩選陽性克隆，菌液提取質(zhì)進(jìn)行粒酶切初步鑒定，后由上海生物工程公司測序
2、鑒定。將序列正確的各重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞，Westernbloting鑒定蛋白表達(dá)。免疫熒光檢測各個截斷體亞細(xì)胞定位。通過TMSG一1基因結(jié)構(gòu)分析，對預(yù)測的核定位序列進(jìn)行缺失研究，構(gòu)建QST5重組質(zhì)粒并觀察亞細(xì)胞定位改變。結(jié)果PCR成功擴(kuò)增得到目的基因片段，并構(gòu)建得到TMSG一1全長及不同截斷片段Tl(aal29一aa380)、T．2(aa71-aa380)、T3(aal-aal28)、T4(aal—aa70、、T5(aa71一aal28)矛u核定位信號缺失體QST5(aa71．a(chǎn)al18)的真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)酶切初步鑒定及基因測序鑒定，各重組質(zhì)?；蛐蛄腥俊篎確，
3、Westernbloting檢測結(jié)果表明各重組的真核表達(dá)載體均有預(yù)期長度的蛋白表達(dá)。免疫熒光結(jié)果表明，含有Homeodomain結(jié)構(gòu)域的截斷體T2、T3及T5能夠入核，其中T2在核內(nèi)彌漫分布，而T3及T5主要定位于細(xì)胞核的核仁部位，缺失預(yù)測核定位信號(NLS)序列的QST5仍定位于細(xì)胞核，但其熒光信號不集中在核仁。不含Homeodomain結(jié)構(gòu)域的TI$11T4定位于細(xì)胞漿。結(jié)論成功構(gòu)建TMSG．1全長及不同截斷片段的真核表達(dá)載體并成功表達(dá)，確定TMSG．1蛋白含有Homeodomain結(jié)構(gòu)域的截斷體能夠入核，而缺失Homeodomain結(jié)構(gòu)域中預(yù)測的核定位序列的截斷體
4、能定位于細(xì)胞核，卻不再集中于核仁，初步確定其核定位信號很有可能為核仁定位信號，具有轉(zhuǎn)錄因子活性引導(dǎo)基因進(jìn)入核仁，為研究TMSG—l蛋白轉(zhuǎn)錄功能奠定基礎(chǔ)，并為腫瘤的基因治療提供新的思路。．碩士研究生：夏巖(病理學(xué))指導(dǎo)教師：項鋒鋼教授關(guān)鍵詞：基因，腫瘤抑制；亞細(xì)胞定位；核定位信號；腫瘤轉(zhuǎn)移Theinvestigationofthetranscriptionalnewfeatureoftumormetastasissuppressorgene1TMSG-1proteinAbstractObjectiveToinvestigatethetranscriptionalactiv
5、ityoftumormetastasissuppressorgene1(TMSG_1)proteinandidentifythenuclearlocalizationsignalofTMSG．1．weconstructed5truncatedeukaryoticexpressionvectorsofTMSG．1containingdifferentfunctionaldomainsofTMSG-1，andexploredthesubcellularlocalizationofdifferenttruncatedproteinsofTMSG-1．MethodsDiffer
6、entgenefragmentscontainingdifferentfunctionaldomainsofTMSG．1wereamplifiedbypolymerasechainreaction(PCR)usingpcDNA3．TMSG．1asthetemplate．ThegenefragmentswereconnectedwitheukaryoticexpressionvectorpcDNA3afterthefragmentswerecutbylimitedincisionenzymesandthentherecombinedvectorsweretransform
7、edtocompetentcellsDH5a．Thepositivecolonswereselectedbyampicillin。Thelimitedincisionenzymesandgenesequencingwereappliedtoidentifythecorrectrecombinedvectorswhichhadcorrectsequence．TheeukaryoticexpressionvectorswerethentransfectedintoHelacells．Theexpressionsofthesefusionpro
