afp啟動子慢病毒載體地構(gòu)建及人胎肝干細(xì)胞研究

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1、摘要世界上對干細(xì)胞的研究已有多年的歷史,它已經(jīng)成為當(dāng)今生命科學(xué)研究的前沿之一。當(dāng)前,由于各種肝病患者不斷增長和肝臟捐獻器官來源的缺乏,對肝:f,_細(xì)胞的研究已經(jīng)成為熱點,這將有助于更好的了解許多肝臟疾病的產(chǎn)生機理和可能的治療途徑.而胎肝是研究肝干細(xì)胞很好的實驗材料。本文通過以下三個方面對胎肝細(xì)胞的分離,培養(yǎng),體外誘導(dǎo)分化及體內(nèi)移植進行了研究:1將慢病毒載體口lv的CMV啟動子替換為人基因組AFP啟動予,使該病毒感染胎肝細(xì)胞后,在AFP陽性細(xì)胞中表達綠色熒光蛋白,從而可利用流式細(xì)胞儀分選出表達AFP即G

2、FP陽性的胎肝細(xì)胞。該標(biāo)記篩選系統(tǒng)的建立為進一步研究胎肝細(xì)胞的生物學(xué)特性和肝干細(xì)胞的分離和應(yīng)用奠定了良好的基礎(chǔ)。2為了得到大量用于臨床治療和科學(xué)研究的細(xì)胞,僅靠分離原代細(xì)胞,不僅無法得到細(xì)胞量的保障,而且樣品不穩(wěn)定,費用昂貴。解決該問題攝好的方法就是建立穩(wěn)定的原代細(xì)胞系,但通常原代分離胚胎來源的細(xì)胞在培養(yǎng)一段時間后會分化。增殖能力逐漸減弱直到停止分裂。通過兩種方法來建立胎肝來源的細(xì)胞系:分離胎肝細(xì)胞挑取細(xì)胞克隆,與飼養(yǎng)層細(xì)胞共培養(yǎng)來建立細(xì)胞系;分離胎肝細(xì)胞并穩(wěn)定轉(zhuǎn)染hTERT端粒酶基因,使之永生化。3

3、為了研究分離的胎肝細(xì)胞的分化潛能,將其移植到免疫缺陷鼠體內(nèi),經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)它能夠分化為多個組織的細(xì)胞。關(guān)鍵詞:胎肝細(xì)胞;免疫缺陷鼠:AFP啟動子;端粒酶:永生化;流式細(xì)胞術(shù):移植:免疫組織化學(xué)ABSTRACTStemcellhasbeenstudiedformanyyearsandhasbecamingoneofthefocusesintheworld.Andduetotheincreasingofliverdiseaseandthelackoflivercontribution,moleandmores

4、cientiststudyliverstemcells.Thesestudeswillcontributetobetterunderstandingthecharacterizationandtreatmentofengenderingliverdisease.AndfetalliverisallexcellentresoLlrceofliverstemcell.Westudytheseparation,culture,inducingdifferentiationandtansplantationo

5、fhumanfetallivercellsthroughthefollowingways:1ToisolatetheAFPpositivefetallivercellsbyFASC,WeconstructarecombinantlentiviralvectorplybyreplacingitsCMVpromotertoAFPpromoterwhichcanspeciallyexpressEGFPinAFPproducingccUs.Thisselectionsystemmay西Vemoresuppor

6、ttOstudythecharacteristicoffetalliverstemcellsandtotheisolationandapplicationofliverstemcells.2Itishardtogetenoughcellsforstudyorclinictreatmentonlybyseparating,andalsoitisunstableandexpensive.Thebestwaytosolvethisproblemistoestablishastablecellline.Int

7、hisstudy,Weestablishhumanfetallivercelllinebytwoways:selecttheclonalfetalliverstrainsandcocultulewithfeedercells;immortalizefetallivercellsbyusingaretrovirusvectorexpressingthehTERT.3Tostudythedifferentiationpotentialofhumanfetalliverceils,wetartsplanti

8、ttoNOD—SCIDmouseandproveitsabilityofdifferentiatinngintoseveraltissuecells.Keywords:fetallivercells;NOD-SCIDmouse;勰Ppromoter;telomerase;immortalizeFACS;transplantation;immunochistochemistry21引言第一章文獻綜述世界上對干細(xì)胞的研究已有多年的歷史,由于其在基礎(chǔ)理論研究、

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