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《菠菜膽堿單加氧酶基因cdna的克隆及重組植物表達載體的構建》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、http://www.paper.edu.cn菠菜膽堿單加氧酶基因cDNA的克隆及重組植物表達1載體的構建1，21，22，3柳娜，王蒂，司懷軍1甘肅農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，蘭州（730070）2甘肅省作物遺傳改良與種質創(chuàng)新重點實驗室，蘭州（730070）3甘肅農(nóng)業(yè)大學生命科學技術學院，蘭州（730070）E-mail：wangd@gsau.edu.cn摘要：從菠菜葉片中提取總RNA，用RT-PCR方法擴增到菠菜膽堿單加氧酶（CMO）基+因cDNA，然后將CMOcDNA克隆至pBluescriptSK載體上，序列分析結果表明該CMOcDNA全長為1424bp，開
2、放閱讀框1320bp，編碼440個氨基酸。核酸序列同源性分析表明，該cDNA與已發(fā)表的菠菜CMO基因具有99.8%同源性，氨基酸序列同源性達99.6%。在此基礎上以pBI121和pBIrd為基礎，構建了組成型啟動子CaMV35S和逆境誘導表達啟動子rd29A驅動的CMO基因的植物表達載體。關鍵詞：菠菜；膽堿單加氧酶基因；克?。槐磉_載體構建干旱和鹽堿是影響植物生長發(fā)育最主要的非生物脅迫因子，許多植物對干旱和鹽堿比較敏感，缺乏有效的抗旱機理，從而造成作物產(chǎn)量的嚴重損失。但某些高等植物在鹽、干旱等滲透脅迫下，可以大量合成并積累甜菜堿作為無毒的滲透調節(jié)劑，起著
3、調節(jié)滲透壓，保護胞[1]內酶活性的作用。甜菜堿是甘氨酸的衍生物,被認為是最好的滲透調節(jié)劑。在高等植物中，甜菜堿經(jīng)兩步酶催化得到，即膽堿→甜菜堿醛→甜菜堿，催化第一步反[2-3]應的酶是膽堿單加氧酶（cholinemonooxygenase，CMO）,催化第二步反應的酶是甜菜堿[4-6]醛脫氫酶（betainealdehydedehydrogenase,BADH），這兩種酶是控制甜菜堿合成的兩個[7]關鍵酶。Rathinasabapathi等首先從菠菜葉片中克隆了CMO的完整cDNA，該cDNA全[8][9]長1622bp。隨后，藜科的甜菜、山菠菜CMO
4、cDNA全序列也被克隆并分析其序列，發(fā)現(xiàn)不同植物之間CMO基因及氨基酸序列同源性較高。本研究從菠菜葉片中克隆了CMO基因，并構建了組成型啟動子CaMV35S和逆境誘導表達啟動子rd29A驅動的CMO基因的植物表達載體，以進一步轉化農(nóng)作物，提高其抗旱耐鹽能力。1.材料和方法1.1實驗材料1.1.1植物材料、質粒和菌株菠菜（SpinaciaoleraceaL.）種子來自市場銷售的種子，種植于溫室內；質粒pBluescript+SK、pBI121（含CaMV35S啟動子）、pBIrd（含rd29A啟動子）由實驗室司懷軍老師提供；大腸桿菌為DH5α。1.1.2
5、主要試劑TMTrizol試劑盒、反轉錄試劑盒、各種限制性內切酶、PyrobestDNA聚合酶、Taq聚合酶、X-gal、IPTG、T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒購自鵬程公司。1本課題得到高等學校博士學科點專項科研基金項目（20050733003）和甘肅省農(nóng)業(yè)生物技術研究與應用開發(fā)項目（GNSW-2006-01）的資助。-1-http://www.paper.edu.cn1.1.3培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件大腸桿菌培養(yǎng)基為LB培養(yǎng)基，培養(yǎng)溫度37℃，搖床轉速200r/min，氨芐青霉素（Amp）濃度為50mg/ml，卡那霉素（Kan）濃度為
6、50mg/ml。1.2實驗方法1.2.1PCR引物的設計利用Primer軟件，根據(jù)已報道的菠菜CMOcDNA序列（GenBankaccessionno.U85780）設計了一對20mer的引物，上游引物L1：5′-AAAAGGAAGTGTTGAGTTGG-3′，下游引物L2：5′-TTTAGGCCATGAGCATACAC-3′，提交上海生物工程有限公司合成。1.2.2RT-PCR擴增CMO基因采用Trizol法從菠菜中提取總RNA，然后通過RT-PCR反轉錄成cDNA。以反轉錄的cDNA為模板，用設計好的上下游引物擴增CMO基因，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測
7、擴增結果。1.2.3中間載體的構建及DNA序列測定+將PCR產(chǎn)物平端克隆至pBluescriptSK載體的SmaI位點，然后轉化大腸桿菌DH5α，經(jīng)藍白斑篩選及PCR擴增產(chǎn)物電泳檢測，挑選陽性菌株擴增后用小量法提取質粒，進行酶切鑒定及序列測定，序列測定由上海生物工程有限公司完成。1.2.4CMO基因植物表達載體的構建+用EcoRV（平末端）和SacI（粘末端）雙酶切重組質粒pBluescriptSK-CMO，得到CMO基因的全長片段，用SmaI（平末端）和SacI（粘末端）雙酶切pBI121載體（含組成型啟動子CaMV35S）和pBIrd載體（含逆境誘
8、導型啟動子rd29A），切去其中的GUS基因，回收載體大片段和CMO基因片段，連接、轉化感受態(tài)
