抗肝癌米托蒽醌免疫毫微粒的體外抗癌活性研究

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1、第14卷第2期同　位　素Vol.14No.22001年5月JournalofIsotopesMay2001抗肝癌米托蒽醌免疫毫微粒的體外抗癌活性研究12331李云春,王仲瓊,蔡美英,劉曉波,匡安仁(11四川大學(xué)華西醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科,四川成都　610041;21四川大學(xué)華西醫(yī)院檢驗(yàn)科,四川成都　610041;31四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫室,四川成都　610041)摘要:采用花環(huán)形成及花環(huán)形成阻斷實(shí)驗(yàn)和免疫熒光染色及其阻斷實(shí)驗(yàn)研究抗肝癌米托蒽醌免疫3毫微粒(HAb182DHAQ2BSA2NP)體外靶向人肝癌細(xì)胞的特性,并利用H2TdR摻入法

2、研究其選擇性靶向殺傷人肝癌細(xì)胞的作用。結(jié)果顯示,HAb182DHAQ2BSA2NP能有效地特異性靶向結(jié)合人肝癌細(xì)胞,且對(duì)人肝癌細(xì)胞具有特異性殺傷作用,這種殺傷作用的特異性由人肝癌單克隆抗體HAb18決定。關(guān)鍵詞:米托蒽醌;免疫毫微粒,抗肝癌;體外,抗癌活性中圖分類號(hào):R73517文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A文章編號(hào):100027512(2001)0220071205以抗體為導(dǎo)向載體實(shí)現(xiàn)化療等殺傷性藥物選擇性殺傷癌細(xì)胞是目前研究包括肝癌在內(nèi)的[1]所有腫瘤導(dǎo)向治療藥物的一個(gè)方向,且已具有初步的臨床療效。但仍存在著載藥量低,“彈[2]頭”殺傷力不強(qiáng),抗體的動(dòng)物

3、源性如鼠源性等缺陷。免疫毫微粒是粒徑為納米級(jí)的膠態(tài)固體顆粒,其載藥量較大,有緩釋藥物性,且能通過抗體特異性導(dǎo)向?qū)崿F(xiàn)對(duì)癌細(xì)胞主動(dòng)選擇性結(jié)合[3～6]殺傷,不損傷正常組織或減小了對(duì)其損傷。文獻(xiàn)[7]制備了抗肝癌米托蒽醌(DHAQ)免疫毫微粒(HAb182DHAQ2BSA2NP),其表面抗人肝癌單克隆抗體HAb18的量為315mg?g。本工作擬對(duì)其體外靶向人肝癌細(xì)胞的結(jié)合特性和殺傷癌細(xì)胞的活性進(jìn)行研究。1　實(shí)驗(yàn)材料111　主要試劑3人肝癌細(xì)胞SMMC27721:四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫室提供;H2TdR:中國科學(xué)院上海原子核研究所生產(chǎn);1

4、640培養(yǎng)液:美國Gibcobrl公司生產(chǎn);人胃癌細(xì)胞株SGC27901:四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生化室提供;抗人肝癌單克隆抗體HAb18:第四軍醫(yī)大學(xué)制備;熒光標(biāo)記羊抗小鼠免疫球蛋白(IgG2FITC):華美生物工程公司生產(chǎn);磷酸緩沖液(PBS):自制,濃度為0105mol?L,pH715;DHAQ牛血清白蛋白(BSA)毫微粒(NP)DHAQ2收稿日期:2000208228;修回日期:2000212217基金項(xiàng)目:衛(wèi)生部科研基金資助項(xiàng)目(98212225)作者簡介:李云春(1966～),男(漢族),四川省射洪人,副研究員,核醫(yī)學(xué)專業(yè)7

5、2同　位　素　　　　　　　　　　　　　　　　　第14卷　BSA2NP:自制;HAb182DHAQ2BSA2NP:自制;對(duì)照免疫毫微粒4E32DHAQ2BSA2NP(4E3為抗人膀胱癌單克隆抗體):自制。112　主要儀器PM2CBAD型倒置顯微鏡和熒光顯微鏡:日本Olympus公司生產(chǎn);FH463A自動(dòng)定標(biāo)器:北京核儀器廠生產(chǎn);H2600IV型電子顯微鏡:Hitachi公司生產(chǎn)。2　實(shí)驗(yàn)方法211HAb18-DHAQ-BSA-NP的體外靶向結(jié)合人肝癌細(xì)胞的研究[8]21111花環(huán)形成及花環(huán)形成阻斷實(shí)驗(yàn)?、賹⑸L良好的靶細(xì)胞SMMC27721和對(duì)

6、照細(xì)胞SGC27901經(jīng)5mL、20%的胰蛋白酶消化2h后離心,用含5%小牛血清的PBS洗滌沉淀后將5沉淀配制成2×10?mL細(xì)胞懸液,加入免疫毫微粒(HAb182DHAQ2BSA2NP或4E32DHAQ2BSA2NP)或毫微粒(DHAQ2BSA2NP),室溫振蕩60min,離心,沉淀用PBS洗滌3次后于光鏡下觀察細(xì)胞和微粒的結(jié)合情況,即花環(huán)形成情況。以結(jié)合4個(gè)以上微粒的細(xì)胞為陽性,以100個(gè)細(xì)胞中的陽性細(xì)胞數(shù)為花環(huán)形成率。②取靶細(xì)胞SMMC27721懸液與不同濃度HAb18抗體混合,離心,用PBS洗滌沉淀3次,在沉淀中加入免疫毫微粒,室溫振

7、蕩60min,光鏡下觀察其花環(huán)形成情況。用同樣的方法計(jì)算花環(huán)形成率。21112　免疫熒光染色及其阻斷實(shí)驗(yàn)?、偃Ab182DHAQ2BSA2NP,加入等量羊抗小鼠IgG2FITC,4℃作用30min,離心,用PBS洗滌沉淀3次,置沉淀于熒光顯微鏡下觀察其免疫熒光染色效果。用同樣的方法對(duì)DHAQ2BSA2NP進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。②取生長良好的靶細(xì)胞SMMC27721或?qū)φ占?xì)胞SGC27901懸液加入等量FITC2HAb182DHAQ2BSA2NP,4℃作用30min,離心,用含5%小牛血清的PBS洗滌沉淀3次,將沉淀置于熒光顯微鏡下,觀察熒光標(biāo)記免疫毫微

8、粒與細(xì)胞的結(jié)合情況。③取靶細(xì)胞懸液與不同濃度HAb18混合,4℃作用30min,離心,用PBS洗滌沉淀3次,加入FITC2HAb182DHAQ2BSA2NP,4℃作