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《攜帶不同ORF3基因的豬流行性腹瀉病毒的拯救及其在VERO細胞上的增殖特性研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文學(xué)校代碼：10264研究生學(xué)號：M150104112上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文攜帶不同ORF3基因的豬流行性腹瀉病毒的題目：拯救及其在VERO細胞上的增殖特性研究RescueofPorcineEpidemicDiarrheaVirusCarryingDifferentORF3GenesandStudy英文題目：ofTheirProliferationCharacteristicsonVEROCells專業(yè)：臨床獸醫(yī)學(xué)研究方向：動物病毒學(xué)姓名：胡曉霞指導(dǎo)教師：李震二O一八年五月上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文上海海洋大學(xué)碩士學(xué)
2、位論文上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文答辯委員會成員名單姓名工作單位職稱備注李家樂上海海洋大學(xué)教授主席張德福上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究員委員劉惠莉上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究員委員鄭洪建上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究員委員蔣杰賢上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究員委員范曉芬上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院助理研究員秘書上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院答辯地點華漕院區(qū)機關(guān)二樓答辯日期2018.5.25會議室上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文攜帶不同ORF3基因的豬流行性腹瀉病毒的拯救及其在VERO細胞上的增殖特性研究摘要豬流行性腹瀉（Porcineepidemicdiarrhea，PED）是由豬流行性腹瀉病毒（Porcinee
3、pidemicdiarrheavirus，PEDV）感染豬而引起的一種急性腸道傳染病，常導(dǎo)致病豬水樣腹瀉、嘔吐、脫水。自2010年起，其大規(guī)模的爆發(fā)給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失。PEDV屬冠狀病毒科α冠狀病毒屬，其基因組為單股正鏈RNA，編碼非結(jié)構(gòu)蛋白1A/1B和結(jié)構(gòu)蛋白S、E、M、N。Orf3是位于PEDVs基因和e基因之間的第三閱讀框，是目前發(fā)現(xiàn)的PEDV的唯一一個附屬基因，編碼ORF3蛋白，有關(guān)其功能是PEDV的研究熱點之一。獸醫(yī)界普遍認為其與PEDV的毒力相關(guān)，但在現(xiàn)有的研究中，受研究手段的限制，對其生物學(xué)作用和機理還了解不多。本研
4、究的研究內(nèi)容及結(jié)果如下：（1）3株重組病毒的拯救及鑒定。通過構(gòu)建帶有不同orf3基因及orf3基因缺失的重組質(zhì)粒，利用基于RNA同源重組的PEDV反向遺傳學(xué)操作系統(tǒng)拯救3株攜帶有不同orf3基因及orf3基因缺失的重組PEDV，終末稀釋法純化病毒，并經(jīng)RT-PCR法和免疫組化對獲得的重I上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文組病毒進行鑒定。RT-PCR結(jié)果及細胞病變觀察證明成功拯救到了攜帶不同orf3基因及orf3基因缺失的重組PEDV；進一步的免疫組化分析結(jié)果證實重組PEDV的ORF3蛋白存在于其感染的Vero細胞中。（2）病毒生長曲線的繪制。將獲得
5、的重組PEDV及實驗室已保attwt存的重組病毒rDR13-ORF3和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero細胞，分別于感染的第8、16、24、32、40、48h后，反復(fù)凍融3次，測定其TCID50并繪制以病毒感染時間為橫坐標，TCID50為縱坐標的病毒生長曲線。測得的TCID50經(jīng)SPSS分析表明攜帶有orf3基因的PEDV滴度（TCID50）顯著高于缺失orf3基因的重組PEDV（p＜0.05）。（3）5株病毒感染細胞不同時間測定殘留細胞數(shù)量。方法一：全自動細胞計數(shù)分析儀計數(shù)。將獲得的重組PEDV及實attwt驗室已保存的重組病毒
6、rDR13-ORF3和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero細胞，分別在感染25和36h利用全自動細胞計數(shù)分析儀對感染后的殘留活細胞進行計數(shù)。結(jié)果表明攜帶有orf3基因的PEDV感染Vero細胞25和36h時測的活細胞數(shù)顯著高于缺失orf3基因的重組PEDV（p＜0.05）。方法二：CCK-8試劑盒測定病毒感染后殘留活細胞數(shù)量。將獲得attwt的重組PEDV及實驗室已保存的重組病毒rDR13-ORF3和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero細胞，并于感染后的第12、24、36、48h測定病毒感染后Vero細胞OD450值。SPSS
7、分析表明，病毒感染Vero細胞12h時，5株病毒感染的Vero細胞OD450值差異并不顯著；病毒II上海海洋大學(xué)碩士學(xué)位論文感染24和48h后帶有orf3基因的重組病毒活細胞OD450值顯著高于orf3基因缺失的重組PEDV（p＜0.05），而在病毒感染36h后結(jié)果相似，但差異達極顯著（p＜0.01）。此結(jié)果進一步驗證了細胞計數(shù)儀檢測的結(jié)果。（4）細胞活性的測定。將獲得的重組PEDV及實驗室已保存的attwt重組病毒rDR13-ORF3和DR13弱毒株以MOI=0.1感染Vero細胞，并于感染后的第12、24、36、48h測定病毒感染后V
8、ero細胞OD450值。根據(jù)細胞活力計算公式將測得的OD450計算為細胞活力，其結(jié)果經(jīng)SPSS分析顯示，病毒感染Vero細胞12h時，5株病毒感染的Vero細胞活性差異并不顯著，感染24、48
