水牛、豬gcnf和sf-1基因克隆與表達規(guī)律的初步研究

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1、分類號——UDC碩士學(xué)位論文密級水牛、豬GCNF和SF．1基因克隆與表達規(guī)律的初步研究蘇節(jié)指導(dǎo)教師互德遂巫究員塞4迭友班究員論文答辯日期2Q13璽魚旦3旦學(xué)位授予日期——答辯委員會主席點壺逸數(shù)握．廣西大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性和使用授權(quán)聲明ULlllllllLlllIIllllUllllllllillY2407960本人聲明所呈交的論文，是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進行研究所取得的研究成果。除已特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含本人或他人為獲得廣西大學(xué)或其它單位的學(xué)位而使用過的材料。與我一

2、同工作的同事對本論文的研究工作所做的貢獻均已在論文中作了明確說明。本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下所完成的學(xué)位論文及相關(guān)的職務(wù)作品，知識產(chǎn)權(quán)歸屬廣西大學(xué)。本人授權(quán)廣西大學(xué)擁有學(xué)位論文的部分使用權(quán)，即：學(xué)校有權(quán)保存并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交學(xué)位論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索和傳播，可以采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于：口保密，在年解密后適用授權(quán)。函不保密。(請在以上相應(yīng)方框內(nèi)打“√”)論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：作者聯(lián)系電話：函、午加l裙加)睜p日期：Z．

3、p，，．彳．廠強強馴；．5．歲電子郵箱：198964717@qq．com水牛、豬GCNF和SF-1基因克隆與表達規(guī)律的初步研究摘要生殖細胞核受體(Germcellnuclearfactor，咖)和類固醇生成因子(Steroidogenicfactor1，SF．1)是核受體超家族中的孤兒核受體成員，它們在胚胎發(fā)育、性腺分化、內(nèi)分泌及生殖調(diào)控等多個方面發(fā)揮十分重要的作用。本研究以本地沼澤型水牛和家豬為研究對象，應(yīng)用RT-PCR的方法克隆GCNF和SF一1基因的編碼區(qū)序列，通過qRT-PCR技術(shù)分析GCNF和SF．1在不同組織的表達，并應(yīng)

4、用免疫組化技術(shù)對其蛋白在卵巢和睪丸組織的定位進行分析。此外還應(yīng)用qRT-PCR系統(tǒng)地研究了GCNF和SF．1基因在卵泡發(fā)生和早期胚胎發(fā)育過程中的表達規(guī)律，并從甲基化和miRNA兩個層面對其基因表達調(diào)控的分子機制進行了探討。主要研究結(jié)果如下：1．GCNF和SF．1基因全長編碼區(qū)序列片段的克隆。測序結(jié)果顯示水牛和豬GCNF基因包含全長編碼區(qū)片段大小分別為1391bp和1572bp，分別編碼435和450個氨基酸殘基。多重序列比較結(jié)果顯示，水牛GCNF基因氨基酸序列與豬、羊、小鼠、人和黑猩猩的相似性分別為97％、97％、97％、96％和9

5、7％。水牛和豬SF一1基因包含全長編碼序列的擴增片段大小分別為1490bp和2002bp，均編碼461個氨基酸殘基。多重序列比較結(jié)果顯示，水牛SF'I基因氨基酸與豬、羊、小鼠、人和黑猩猩的相似性分別為96％、98％、94％、94％和95％。在氨基酸和核苷酸水平上GCNF和SF-1基因在不同物種中具有較高保守性。蛋白二級結(jié)構(gòu)分析結(jié)果顯示GCNF和SF．1蛋白主要以p．轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲為主，其次是昏螺旋，p．折疊較少，兩種蛋白均含有鋅指結(jié)構(gòu)和配體結(jié)合域結(jié)構(gòu)，具備結(jié)合DNA特征的典型核受體結(jié)構(gòu)。2．不同組織基因表達譜構(gòu)建及在性腺組織中的定

6、位。應(yīng)用qRT-PCR技術(shù)，檢測了GCNF和sF．1基因在水牛不同組織的表達。結(jié)果顯示，水牛lGCNF基因在睪丸(相對表達量為24．9±0．02)和卵巢(24．1±0．16)組織表達水平較高，顯著高過在皮膚(1．0_0．29)、腎臟(O．77±0．11)、大腦(O．48±0．26)、肝(O．46±0．02)、生殖嵴(O．45±0．02)、肌肉(0．43±0．01)、骨骼(O．31±O．26)和垂體(O．25±0．01)等組織的表達。水牛SF．1在睪丸(17．8±0．16)、卵巢(12．1±0．03)及生殖嵴中(7．7±0．02)表達

7、水平較高，在大腦(3．1±0．01)、肝臟(1．8±0．12)、皮膚(1．8±0．11)和垂體(1．0±0．3)有一定的表達，而腎臟(O．79±0．68)、骨骼(0．65±0．03)和肌肉(0．58±o．18)等組織表達量均較低。免疫組化結(jié)果顯示GCNF基因在卵巢中原始卵泡和初級卵泡的卵母細胞和顆粒細胞中均呈強陽性且主要在細胞核中表達，在次級卵泡和有腔卵泡中，卵泡膜細胞和壁顆粒細胞呈強陽性，而卵丘細胞和卵母細胞呈弱陽性；SF．1基因在原始卵泡的卵母細胞核中呈強陽性染色，在初級和次級卵泡中的顆粒細胞和卵母細胞中均呈強陽性，在有腔卵泡中

8、，卵丘細胞呈強陽性染色，而在卵母細胞中表達量較弱。在睪丸組織中，GCNF和SF．1蛋白均存在于曲細精管生精上皮的生精細胞中，推測GCNF和SF—l在卵泡發(fā)生和精子發(fā)生過程中起著重要的作用。3．卵母細胞成熟前后和早期胚胎中的表達譜研究。