毛蕊異黃酮對秀麗隱桿線蟲壽命的影響及分子機(jī)制研究

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1、毛蕊異黃酮對秀麗隱桿線蟲壽命的影響及分子機(jī)制研究TheeffectofcalycosinonCaenorhabditiseleganslifespananditsmolecularmechanism學(xué)科專業(yè)：微生物與生化藥學(xué)研究生：路璐璐指導(dǎo)教師：周立軍副教授天津大學(xué)藥物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院二零一七年五月萬方數(shù)據(jù)萬方數(shù)據(jù)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作和取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝之處外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得天津大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使

2、用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解天津大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定。特授權(quán)天津大學(xué)可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學(xué)校向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)說明）學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽名：簽字日期：年月日簽字日期：年月日萬方數(shù)據(jù)萬方數(shù)據(jù)摘要毛蕊異黃酮(calycos

3、in)是一種黃酮類化合物，主要存在于黃芪的根中。目前報(bào)道的毛蕊異黃酮的藥理作用主要涉及抗菌及抑制病毒作用,能夠降血脂、降血糖、減少糖尿病并發(fā)癥等。毛蕊異黃酮的抗氧化活性也逐漸引起人們的關(guān)注研究。但是，目前還未有關(guān)于毛蕊異黃酮的抗衰老研究報(bào)道。目的：以秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans，C.elegans)為生物模型，探討毛蕊異黃酮對其壽命的影響及其內(nèi)在的分子機(jī)制。方法：1.壽命分析實(shí)驗(yàn)：線蟲同期化后長至L4期，而后轉(zhuǎn)移至空白對照組和毛蕊異黃酮給藥組逐天記錄線蟲壽命，評價(jià)毛蕊異黃酮對線蟲壽命的影響并且篩選出

4、給藥組中的最佳濃度。2.抗應(yīng)激能力實(shí)驗(yàn)：利用百草枯或給予熱刺激引發(fā)線蟲體內(nèi)的過氧環(huán)境，觀察記錄線蟲的壽命變化，以此判斷毛蕊異黃酮的抗氧化性。3.線蟲體內(nèi)活性氧簇(reactiveoxygenspecies，ROS)檢測：檢測毛蕊異黃酮對線蟲體內(nèi)ROS的清除能力以進(jìn)一步說明毛蕊異黃酮的抗氧化能力。4.DAF-16和SKN-1的亞細(xì)胞定位實(shí)驗(yàn)：給藥2h后觀察記錄DAF-16::GFP及SKN-1::GFP轉(zhuǎn)基因線蟲中DAF-16的亞細(xì)胞定位情況,以判斷毛蕊異黃酮對線蟲中的轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)生何種影響。5.突變株壽命實(shí)驗(yàn)：探討毛蕊異黃酮對線

5、蟲壽命影響可能的內(nèi)在分子機(jī)制。6.分子機(jī)制實(shí)驗(yàn)：毛蕊異黃酮給藥三天后提取線蟲內(nèi)總RNA，利用熒光定量PCR檢測野生型N2中daf-16及下游相關(guān)基因sod-3、ctl-1、hsp-16.2以及daf-2(e1370)突變株中daf-16的表達(dá)量變化。7.咽泵實(shí)驗(yàn)：記錄比較毛蕊異黃酮給藥組與空白對照組線蟲在1min內(nèi)的咽泵次數(shù)以及限食通路相關(guān)突變株eat-2(ad1116)壽命實(shí)驗(yàn)，綜合判斷毛蕊異黃酮的延壽效果是否與熱量限制途徑有關(guān)。結(jié)果：1.壽命分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，毛蕊異黃酮在一定的濃度范圍內(nèi)可不同程度延長線蟲壽命，且200μM

6、毛蕊異黃酮為最佳給藥濃度并用作后續(xù)實(shí)驗(yàn)給藥組。2.毛蕊異黃酮顯著提高了野生型線蟲在熱、氧應(yīng)激刺激下也就是體內(nèi)過氧環(huán)境下的存活率，表明毛蕊異黃酮的抗氧化活性與其延長線蟲壽命有關(guān)。3.毛蕊異黃酮明顯降低了線蟲體內(nèi)ROS的水平，進(jìn)一步說明其抗氧化性與延長壽命有關(guān)。4.在分子機(jī)制研究中，毛蕊異黃酮不能延長daf-2(e1370),age-1(hx546)及daf-16(mgDf50)突變株的壽命，說明其延壽功效是通過胰島素信號通路實(shí)現(xiàn)的，另外，毛蕊異黃酮提高了N2中的daf-16的mRNA水平而對daf-2(e1370)中daf-16

7、的mRNA水平無影響則進(jìn)一步說明毛蕊異黃酮延長線蟲壽命與胰島素信號通路有關(guān)。5.毛蕊異黃酮不能延長daf-16(mgDf50)突變株的壽命卻對skn-1(zu169)突變株保持延壽功效，再者，毛蕊異黃酮能夠提高N2中DAF-16的入核水平而對I萬方數(shù)據(jù)SKN-1無影響，說明毛蕊異黃酮延壽功能主要是通過DAF-16這一轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)的。毛蕊異黃酮大大提高了daf-16下游的sod-3,hsp-16.2,ctl-1的水平，表明毛蕊異黃酮激活了轉(zhuǎn)錄因子DAF-16并提升了抗應(yīng)激基因的表達(dá)。6.毛蕊異黃酮能夠延長unc-43(n1186

8、)突變株的壽命說明其延壽作用與unc-43無關(guān)。7.毛蕊異黃酮對N2線蟲的咽泵頻率無明顯影響，并能延長限食通路相關(guān)突變線蟲eat-2(ad1116)的壽命，從而確認(rèn)毛蕊異黃酮的延壽作用不是通過熱量限制途徑實(shí)現(xiàn)的。結(jié)論：以線蟲為生物模型，初步探索了毛蕊異黃酮的延壽功效及其內(nèi)在的