抗重金屬鉛離子mab的制備及elisa檢測方法的建立

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1、PreparationofMonoclonalAntibodiesAgainstHeavyMentalLeadIonandEstablishmentofELISAMethodADissertationSubmittedinPartialFulfillmentoftheRequirementsfortheDegreeofMasterofEngineeringAgronomyCandidate:LiYiSupervisor:Prof.WangZi-liangHenanInstituteofScienceandTechnologyJ

2、une,2015本研究由―十二五‖國家科技支撐計劃專題―重金屬離子抗體的制備及其產(chǎn)品研發(fā)‖(2011BAK10B01-15)提供資助摘要鉛是的用處極廣,同時也是對人類危害最大的重金屬。近年來,鉛的污染問題日益嚴重,遭受其危害的人數(shù)也越來越多。鉛對機體毫無益處,對神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)等都有毒害作用。由于重金屬傳統(tǒng)檢測方法的諸多弊端,本論文利用免疫學分析技術(shù)制備出抗鉛離子單克隆抗體,研制出鉛離子檢測試劑盒,建立了重金屬鉛離子快速檢測體系。通過異硫氰酯法將鉛離子和蛋白分子(BSA/OVA)偶聯(lián)到雙功能偶

3、聯(lián)劑ITCBE上,2+2+制備出人工抗原Pb-ITCBE-BSA和Pb-ITCBE-OVA,并通過包括紫外分光光度法、ICP-AES法、SDS-PAGE、免疫鼠多抗血清ELISA鑒定,證明人工抗原制備成功。其結(jié)2+2+果為:Pb-ITCBE-BSA和Pb-ITCBE-OVA的蛋白濃度分別為5.26mg/mL、6.90mg/mL,2+2+其Pb含量分別為46.14mg/L、18.60mg/L;Pb-ITCBE-BSA免疫小鼠后效價達到1:52+1.024×10,阻斷ELISA檢測到多抗血清對Pb的半數(shù)抑制濃度IC50為25.88

4、ng/mL,與其他重金屬離子基本上無交叉反應。2+用Pb-ITCBE-BSA免疫5只Balb/C小鼠,通過ELISA檢測多抗血清的方法挑選出最優(yōu)小鼠,取其脾臟與NS0細胞進行融合。通過ELISA法對雜交瘤細胞上清液進行檢2+測后,篩選出1B7F4,2G5A2,2B7C11三株對Pb敏感特異的單克隆雜交瘤細胞株。2+運用體外誘生腹水法大量制備抗重金屬Pb單克隆抗體。其結(jié)果為:1B7F4,2G5A2,332B7C11三株單抗細胞株上清液ELISA檢測效價分別為1:2.56×10、1:1.28×10、1:32.56×10,IC50分

5、別為37.068ng/mL、45.081ng/mL、34.276ng/mL,其同種型鑒定結(jié)果分別為IgG1/κ、IgG1/λ、IgG2a/κ,與其他重金屬基本上無交叉反應。其中特異性最好的952B7C11單抗細胞株親和常數(shù)Ka為2.69×10,腹水效價為1:1.6384×10.2+對試劑盒最佳工作濃度的選擇進行測定,用2B7C11株產(chǎn)生的單抗組裝Pb檢測試劑盒,并對其性能進行測定。該試劑盒的靈敏度為5.32ng/mL.飼料樣、豬尿樣、豬血清樣的平均添加回收率分別為82.14、82.76%、82.64%,平均批內(nèi)變異系數(shù)分別為1

6、4.5%、14.2%、13.2%,平均批間變異系數(shù)分別為13.23%、11.73%、14.3%,與其他重金屬基本上無交叉反應,且試劑盒性能穩(wěn)定。2+2+關(guān)鍵詞:重金屬Pb;人工抗原;單克隆抗體;Pb檢測試劑盒IABSTRACTLeadisnacessaryindailylife,meanwhileitisoneofthemosttoxicheavymentals.Thepollutionofleadisgettingseriousinrecentyears,andthisisendangeringhuman.Leadpoiso

7、ninghasbeenshowntobetoxictothenervous,cardiovascular,genital,digestiveand2+immunesystem.ImmunoassaysforquantitativemeasurementofPbofferseveraladvantages2+overothertraditionalmethods.Ourstudygetthemonoclonalantibody(mAb)toagainstPb,andusedthemAbdevelopedthequantitati

8、veindirectELISAfortheleadionwasusedtodetectenvironmentalleadcontentinwatersourcesorothersamples.Alead-chelate-proteinconjugatewaspreparedv

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