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《戊型肝炎病毒（hev）組成和結(jié)構(gòu)的分析及其orf2蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中表達(dá)的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、中文摘要戊型肝炎（HepatitisE，HE）是一種由戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)引起的一種急性、自限性病毒性肝炎，其臨床癥狀與甲型肝炎相似，但最近報(bào)道HEV在免疫缺陷或免疫抑制狀態(tài)可引起慢性肝炎。HEV的傳播途徑主要是糞-口傳播，常見(jiàn)方式是通過(guò)污染的水源和食物。我國(guó)是HEV的流行區(qū)，HE占我國(guó)急性病毒性肝炎10%左右，病死率為1.4％－5.3％，在孕婦中的病死率可達(dá)20％，這些數(shù)據(jù)證明，對(duì)戊肝的研究和防治是勢(shì)在必行的。本論文包括了兩部分研究?jī)?nèi)容，第一部分是通過(guò)對(duì)不同來(lái)源的HEV病毒進(jìn)行比較分析，及細(xì)胞培養(yǎng)上清中HEV病毒結(jié)構(gòu)蛋白的
2、分析來(lái)探索HEV病毒的結(jié)構(gòu)及組成蛋白；第二部分是應(yīng)用昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)體系對(duì)HEVVLP的表達(dá)、提取進(jìn)行優(yōu)化，評(píng)價(jià)此條件下制備的HEVVLP的理化性質(zhì)，純度和免疫原性，進(jìn)而為HEVVLP疫苗的生產(chǎn)制備奠定基礎(chǔ)。一、HEV組成和結(jié)構(gòu)的分析由于現(xiàn)有技術(shù)無(wú)法獲取足夠含量的HEV病毒，各研究團(tuán)隊(duì)通過(guò)HEV結(jié)構(gòu)蛋白在體外表達(dá)和感染性克隆這兩種手段對(duì)HEV的結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究。目前對(duì)結(jié)構(gòu)蛋白（ORF2、ORF3蛋白）的研究認(rèn)為，ORF2蛋白為衣殼蛋白，纏繞并保護(hù)HEVRNA，形成病毒顆粒；ORF3蛋白的功能主要是介導(dǎo)病毒出胞，Emerson等人認(rèn)為ORF3蛋白除此作用外，可能對(duì)病
3、毒在細(xì)胞間的傳播也起到了一定作用。對(duì)病毒結(jié)構(gòu)的研究認(rèn)為：不同來(lái)源的病毒具有不同的結(jié)構(gòu)，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的HEV和血液中的HEV具有相似的結(jié)構(gòu)：ORF2與RNA結(jié)合形成核蛋白，ORF3蛋白位于核蛋白表面介導(dǎo)出胞，出胞時(shí)病毒盜取細(xì)胞的脂膜覆蓋于表面；糞便中的HEV病毒由于在排泄過(guò)程中，經(jīng)過(guò)膽汁和消化道中各種酶的作用，病毒表面沒(méi)有ORF3蛋白和脂膜的覆蓋。雖然目前對(duì)病毒的結(jié)構(gòu)蛋白和結(jié)構(gòu)有一定的認(rèn)識(shí)，由于沒(méi)有得到足夠含量的HEV病毒進(jìn)行分析，所以對(duì)于病毒顆粒中ORF2蛋白是否為糖蛋白還沒(méi)能達(dá)成共識(shí)；細(xì)胞培養(yǎng)體系中的病毒顆粒表面的脂膜上是否存在有ORF3蛋白，各研究團(tuán)隊(duì)
4、也存在爭(zhēng)議；同時(shí)，病毒在細(xì)胞間傳播時(shí)，結(jié)構(gòu)蛋白和脂膜對(duì)于病毒和細(xì)胞結(jié)合的影響也沒(méi)有相關(guān)的研究。I本實(shí)驗(yàn)室建立了有效的HEV培養(yǎng)體系，在此基礎(chǔ)上，通過(guò)超速離心和親和層析等方法，對(duì)體系中病毒顆粒進(jìn)行了提取和分析，并與糞便中的病毒顆粒進(jìn)行了比較，確定了培養(yǎng)體系中病毒顆粒表面脂膜的存在。研究結(jié)果表明，兩種不同來(lái)源的HEV在超離純化時(shí)，病毒RNA和ORF2蛋白分別富集于不同的超離層，通過(guò)PLC/PRF/5細(xì)胞的培養(yǎng)檢測(cè)體系對(duì)各超離層的復(fù)制能力進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，病毒的復(fù)制能力與超離層中RNA的含量呈現(xiàn)正相關(guān)性，這一結(jié)果提示細(xì)胞培養(yǎng)上清和糞便中大部分的ORF2蛋白并未結(jié)
5、合RNA組裝形成病毒顆粒，而是以非顆粒的形式出現(xiàn)在超離的頂層，不具有病毒復(fù)制能力。進(jìn)一步對(duì)病毒顆粒所在超離層的密度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，不同來(lái)源的病毒顆粒在超離中具有不同的沉降速率，而細(xì)胞來(lái)源的病毒顆粒在脫脂后，沉降速率與糞便中的病毒顆粒沉降速率一致，這一結(jié)果表明，細(xì)胞培養(yǎng)上清中的病毒顆粒的表面包裹有脂膜。研究進(jìn)一步對(duì)培養(yǎng)系統(tǒng)中的病毒顆粒和ORF2蛋白分別進(jìn)行分析。研究對(duì)培養(yǎng)體系中病毒顆粒在脫脂處理前后與ORF3抗體的親和能力進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示脂膜表面僅有少量ORF3蛋白的存在。細(xì)胞來(lái)源的病毒顆粒在脫脂前與ORF3抗體的親和率僅為3%，脫脂后升至20%；糞便來(lái)源的
6、病毒顆粒脫脂前后沒(méi)有變化，均為0.03%，說(shuō)明在細(xì)胞來(lái)源的病毒表面上，只有少量ORF3蛋白存在于脂膜的表面，糞便來(lái)源的病毒表面既沒(méi)有脂膜的存在，也沒(méi)有ORF3蛋白的存在。對(duì)病毒脫脂和脫ORF3處理前后與細(xì)胞結(jié)合率進(jìn)行的比較發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞來(lái)源的病毒在脫脂前后與細(xì)胞的結(jié)合速率在72小時(shí)內(nèi)沒(méi)有明顯變化，而脫去脂膜和ORF3蛋白的細(xì)胞來(lái)源的病毒和糞便來(lái)源的病毒與細(xì)胞結(jié)合的速率均明顯增高。該結(jié)果表明，脂膜對(duì)病毒與PLC/PRF/5細(xì)胞的結(jié)合沒(méi)有影響，而ORF3蛋白則阻礙了這種結(jié)合。研究同時(shí)對(duì)體系中的ORF2蛋白進(jìn)行了提取和分析，評(píng)價(jià)了其組裝形成病毒顆粒的可能性。通過(guò)對(duì)OR
7、F2蛋白的分析發(fā)現(xiàn)，病毒培養(yǎng)體系中的ORF2蛋白是以糖基化形式存在的88kDa的蛋白，能夠結(jié)合RNA，并形成RNA-ORF2蛋白復(fù)合物。復(fù)合物具有一定的結(jié)構(gòu)，能夠在超離過(guò)程中表現(xiàn)與糞便病毒顆粒相似的沉降速率，這一結(jié)果提示，糖基化的88kDa的ORF2蛋白可能是HEV病毒顆粒的組成蛋白。II二、ORF2蛋白在昆蟲(chóng)細(xì)胞中的表達(dá)對(duì)天然HEV電鏡觀察發(fā)現(xiàn)：HEV為無(wú)胞膜的球形病毒顆粒，90%的顆粒直徑為27-34nm。而對(duì)HEVVLP的研究表明，它也具有顆粒樣的球形結(jié)構(gòu)，電鏡觀察顯示其直徑約為27nm，即HEVVLP結(jié)構(gòu)在形態(tài)上具有和天然病毒顆粒相似的形態(tài)；同時(shí)顆粒
8、性結(jié)構(gòu)使VLP在對(duì)機(jī)體進(jìn)行免疫時(shí)有更強(qiáng)的免疫原性，所
