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1、豬IGF-1R基因多態(tài)性與體長(zhǎng)性狀的相關(guān)性研究StudyonthecorrelationofIGF-1Rgenepolymorphismsandbodylengthinswine作者姓名:張昕專業(yè)名稱:生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師:劉松財(cái)教授學(xué)位類別:理學(xué)碩士答辯日期:2015年06月05日本研究由“國(guó)家自然科學(xué)基金”(項(xiàng)目編號(hào):31072102,31101781)“高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)專項(xiàng)科研基金資助(博導(dǎo)類)”(項(xiàng)目編號(hào):20110061110081)資助SupportedbyNationalNatural
2、ScienceFoundation(No.31072102,No.31101781)SupportedbySpecializedResearchFundfortheDoctoralProgramofHigherEducation(No.20110061110081)中文摘要豬IGF-1R基因多態(tài)性與體長(zhǎng)性狀的相關(guān)性研究小型豬體型矮小,作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型在生物醫(yī)藥研制、人類疾病研究等領(lǐng)域成為開發(fā)利用的新模型。在不同的生長(zhǎng)環(huán)境和不同的經(jīng)濟(jì)條件下培育,小型豬和大型豬在遺傳背景、繁育方式、體長(zhǎng)大小等方面出現(xiàn)變異。因此,
3、闡明小型豬矮小性狀形成的機(jī)制,研究其生長(zhǎng)發(fā)育特點(diǎn)已成為研究熱點(diǎn)。動(dòng)物的生長(zhǎng)是由中樞、外周生長(zhǎng)軸(GH-IGF軸)在復(fù)雜的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)相互作用下共同調(diào)節(jié)完成的,目前胰島素樣生長(zhǎng)因子-1的研究相對(duì)較多,與之結(jié)合的受體IGF-1R基因結(jié)構(gòu)、功能及多態(tài)性研究與體長(zhǎng)性狀的相關(guān)關(guān)系更值得關(guān)注。本研究選用小型豬西藏小型豬、巴馬香豬為研究對(duì)象,以大型豬軍牧1號(hào)白豬、大白豬、長(zhǎng)白山野豬為對(duì)照,以IGF-1R基因?yàn)楹蜻x基因?qū)Σ煌贩N豬不同發(fā)育階段進(jìn)行組織蛋白提取,利用蛋白免疫印跡法、免疫組織化學(xué)分析IGF-1R蛋白表達(dá)差異規(guī)律
4、;利用等位基因特異性PCR方法對(duì)豬IGF-1R基因5’啟動(dòng)子區(qū)、部分基因序列及3’UTR區(qū)序列進(jìn)行SNP位點(diǎn)篩查,統(tǒng)計(jì)各SNP位點(diǎn)基因型及基因頻率分布情況,并預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)與miRNA結(jié)合位點(diǎn)的差異分布;根據(jù)3’UTR區(qū)篩查出的不同SNP位點(diǎn),構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體,檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性來(lái)探討豬體型性狀差異形成的分子機(jī)制。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)從蛋白水平、基因水平及細(xì)胞水平探討不同豬種間IGF-1R基因的分子差異與體長(zhǎng)性狀的相關(guān)性。結(jié)果表明,IGF-1R基因在不同品種豬各組織中均有表達(dá),大型豬IGF-1R的表
5、達(dá)量顯著高于小型豬(p<0.05)。西藏小型豬肝臟組織中蛋白表達(dá)更接近于軍牧1號(hào)白豬,隨日齡的增長(zhǎng)呈先升高后降低,巴馬香豬逐漸升高;西藏小型豬、巴馬香豬、軍牧1號(hào)白豬蛋白含量在肌肉組織中分布規(guī)律一致,均隨日齡的增長(zhǎng)逐步下降;骨組織中大小豬種分布規(guī)律基本一致,出生階段蛋白含量最大,隨日齡先下降后回升;說(shuō)明出生后IGF-1R蛋白表達(dá)在不同體長(zhǎng)性狀豬中存在差異。IIGF-1R啟動(dòng)子區(qū)存在Sp1、MZF1、CdxA、AMl-1a、Nkx-2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs),g.-1165T>C、g.-14
6、40bpC>G;IGF-1R基因3’UTR區(qū)存在2個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)(SNPs),小型豬(TC型)與大型豬(CT型)優(yōu)勢(shì)基因型存在顯著差異(p<0.05);在第19內(nèi)含子處存在g.5C>T。實(shí)驗(yàn)表明:大小豬種對(duì)比優(yōu)勢(shì)基因型不同,可能與豬體長(zhǎng)性狀相關(guān),以上SNP位點(diǎn)可作為影響豬體長(zhǎng)性狀的遺傳標(biāo)記。成功構(gòu)建IGF-1R3’UTR區(qū)大型豬與小型豬突變的雙熒光素酶報(bào)告基因載體,發(fā)現(xiàn)小型豬、大型豬相對(duì)熒光素酶活性低于對(duì)照組。重組質(zhì)粒大型豬與小型豬間檢測(cè)相對(duì)熒光素酶活性接近(p>0.05),說(shuō)明兩SNP位點(diǎn)對(duì)轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)影響不明
7、顯。綜上,IGF-1R基因在大小豬種間表達(dá)水平及基因調(diào)控模式上的差異,推斷可能是影響小型豬體長(zhǎng)性狀的候選基因。為深入研究小型豬生長(zhǎng)發(fā)育機(jī)制以及小型豬資源的開發(fā)和應(yīng)用提供分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等理論基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞:IGF-1R,基因多態(tài)性,小型豬,WesternBlotting,免疫組織化學(xué)IIAbstractStudyonthecorrelationofIGF-1RgenepolymorphismsandbodylengthinswineMiniaturepigshavebeendevelopedandutiliz
8、edasaexperimentalmodelduetotheirsmallbodylength,followingthemice,dogsandotheranimalsintheresearchfieldofbiomedicalresearchorhumandiseasecontrolling.Miniaturepigsandlargepigsexistmutationsonthewayofgene