資源描述：
《轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定eb病毒相關(guān)胃癌差異表達(dá)基因及基因多態(tài)性的研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號(hào)：R373密級(jí)：不保密UDC：610學(xué)校代碼：11065博士學(xué)位論文轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定EB病毒相關(guān)胃癌差異表達(dá)基因及基因多態(tài)性的研究劉術(shù)臻指導(dǎo)教師羅兵教授學(xué)科專業(yè)名稱病原生物學(xué)論文提交日期2015年4月15日論文答辯日期2015年6月2日答辯委員會(huì)主席王志玉教授轉(zhuǎn)錄組測(cè)序鑒定EB病毒相關(guān)胃癌差異表達(dá)基因及基因多態(tài)性的研究中文摘要目的①篩選胃癌細(xì)胞系A(chǔ)GS穩(wěn)定感染EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)后轉(zhuǎn)錄表達(dá)發(fā)生改變的特異基因，以及出現(xiàn)的特異基因結(jié)構(gòu)變化，如單核苷酸多態(tài)性(Singlenucleo
2、tidepolymorphism,SNP)、可變剪切(alternativesplicing,AS)、插入/缺失(insertion/deletion,Indel)等，并對(duì)AGS細(xì)胞系中EBV病毒基因的表達(dá)進(jìn)行分析。②選取轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出的由于EBV感染誘發(fā)的部分差異表達(dá)基因和單核苷酸多態(tài)性變異進(jìn)行驗(yàn)證和比較分析，為篩選與EBVaGC發(fā)生、浸潤、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等有關(guān)的分子標(biāo)記物，闡明EBV致癌機(jī)制及尋找EBVaGC早期診斷、預(yù)后判斷和治療的新靶點(diǎn)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。方法①采用高通量轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)對(duì)AGS細(xì)胞系和穩(wěn)定
3、感染EBV的AGS-EBV細(xì)胞系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，生物信息學(xué)技術(shù)對(duì)測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，包括測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理、基因組比對(duì)、差異表達(dá)基因分析、差異基因mRNAGO(GeneOntology)富集分析、差異基因mRNAKEGG(KyotoEncyclopediaofGenesandGenomes)富集分析以及EBV表達(dá)基因分析。②提取AGS細(xì)胞系和AGS-EBV細(xì)胞系以及EBV陰性胃癌細(xì)胞系(SGC7901,MKN-45,HGC-27)和EBV陽性細(xì)胞系(GT38,GT39,SNU719)總RNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Q
4、uantitativereal-timePCR,qRT-PCR)對(duì)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序篩選出的部分表達(dá)差異且與腫瘤關(guān)系密切的基因(REG4、VEGF、LYPD3、ASNS、NDRG1和APEX1)的轉(zhuǎn)錄表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證。并采用免疫組化技術(shù)檢測(cè)EBVaGC和EBVnGC組織中REG4基因的表達(dá)。③選擇山東地區(qū)胃癌組織標(biāo)本，提取新鮮胃癌組織和石蠟包埋胃癌組織DNA，PCR結(jié)合DNA測(cè)序或限制性片段長度多態(tài)性技術(shù)(restrictivefragmentlengthpolymorphisms,RFLP)檢測(cè)EBVaGC和EBVnGC組織
5、中EDAR,WDR62,GPC4,FLG,CTH,CPOX,SPG11,CASC5及ZFYVE27基因編碼區(qū)特定位點(diǎn)SNP(rs3827760,rs1008328,rs1048369,rs2065955,rs1021737,rs1131857,rs3759871,rs7177192以及rs1088299的分布。其中FLG，CPOX和CTH基因擴(kuò)增產(chǎn)物分別選擇限制性核酸內(nèi)切酶ApalI、HaeIII、ApoI酶切進(jìn)行限制性片段長度多態(tài)性分析，其余6種基因的PCR產(chǎn)物均送上海邁浦基因有限公司采用末端終止法進(jìn)行雙向測(cè)序，
6、Chromas軟件查看測(cè)序峰圖文件，DNAStar軟件(Larsergene，version7.0)進(jìn)行序列剪接和對(duì)比分析，并與相應(yīng)基因序列及基因文庫庫中的標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果①與AGS細(xì)胞系比較，穩(wěn)定感染EBV后，AGS-EBV細(xì)胞系共有3880條基因mRNA出現(xiàn)表達(dá)差異，其中1651條基因表達(dá)上調(diào)，2229條基因表達(dá)下調(diào)。②差異轉(zhuǎn)錄表達(dá)mRNAGO富集分析結(jié)果表明，有較多基因參與蛋白結(jié)合、細(xì)胞質(zhì)、膜整合、細(xì)胞膜、細(xì)胞核和金屬離子結(jié)合等GOterm；共有946差異基因涉及與腫瘤相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞
7、增生、細(xì)胞黏附、腫瘤抑制以及免疫相關(guān)等功能，其中上調(diào)基因360條，下調(diào)基因586條。③差異表達(dá)基因的KEGG分析結(jié)果顯示，較多差異表達(dá)基因參與代謝途徑、腫瘤途徑、細(xì)胞內(nèi)吞以及灶性粘附等途徑。④AGS細(xì)胞穩(wěn)定感染EBV后，細(xì)胞基因出現(xiàn)特征性的結(jié)構(gòu)改變，包括SNP、AS和INDEL等，某些改變可能與差異表達(dá)基因相關(guān)。⑤EBV穩(wěn)定感染的AGS細(xì)胞中，共檢測(cè)到65種EBV基因表達(dá)，以表達(dá)量計(jì)算前10位表達(dá)的EBV基因分別為BXLF2,BXLF1,LF3,BVRF1,BMRF2,BHLF1,LMP2,BILF1,BILF2以
8、及BVLF1。⑥EBV陽性和陰性胃癌細(xì)胞系中，REG4、VEGF、LYPD3、ASNS、NDRG1和APEX1基因表達(dá)差異倍數(shù)和表達(dá)趨勢(shì)與AGS和AGS-EBV兩種細(xì)胞系轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。⑦免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，48例EBVnGC組織中有4例癌細(xì)胞中觀察到REG4陽性信號(hào)，而42例EBVaGC組織均為陰性；統(tǒng)計(jì)學(xué)分析表明，2種胃癌組織中REG4表達(dá)無顯著性
