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1、碩士學(xué)位論文S.pyogenesCas9蛋白的表達(dá)純化及其活性抑制劑篩選的研究RESEARCHONTHEEXPRESSIONANDPURIFICATIONOFS.PYOGENESCAS9ANDSCREENINGOFITSINHIBITIONS王思涵哈爾濱工業(yè)大學(xué)2018年6月國(guó)內(nèi)圖書分類號(hào)：Q71學(xué)校代碼：10213國(guó)際圖書分類號(hào)：577.21密級(jí)：公開(kāi)理學(xué)碩士學(xué)位論文S.pyogenesCas9的表達(dá)純化及其活性抑制劑篩選的研究碩士研究生：王思涵導(dǎo)師：黃志偉教授申請(qǐng)學(xué)位：理學(xué)碩士學(xué)科：生物學(xué)所在單位：生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院答辯日期：2018年6月授予學(xué)位單位：哈爾濱工業(yè)大學(xué)ClassifiedI
2、ndex:Q71U.D.C:577.21DissertationfortheMasterDegreeinScienceRESEARCHONTHEEXPRESSIONANDPURIFICATIONOFS.PYOGENESCAS9ANDSCREENINGOFITSINHIBITIONSCandidate：SihanWangSupervisor：Prof.ZhiweiHuangAcademicDegreeAppliedfor：MasterofScienceSpeciality：BiologyAffiliation：SchoolofLifeScienceandTechnologyDateofDefen
3、ce：June,2018Degree-Conferring-Institution：HarbinInstituteofTechnology哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文摘要CRISPR/Cas9系統(tǒng)是由細(xì)菌與古生菌編碼的適應(yīng)性免疫系統(tǒng)，S.pyogenesCas9屬于TypeII-A型CRISPR/Cas系統(tǒng)，包括CRISPRRNA（crRNA），反式激活CRISPRRNA（tracrRNA）和Cas9蛋白。短的外源DNA片段插入到CRISPR基因座中，然后轉(zhuǎn)錄并加工成crRNA，crRNA和tracrRNA形成與目的DNA互補(bǔ)的雙鏈RNA結(jié)構(gòu)并介導(dǎo)Cas9對(duì)標(biāo)靶DNA的切割。為了使CRISP
4、R/Cas9更好的應(yīng)用于基因組工程，將crRNA和tracrRNA融合形成single-giudeRNA來(lái)介導(dǎo)Cas9對(duì)雙鏈DNA進(jìn)行定點(diǎn)編輯。目前CRISPR/Cas9已經(jīng)成為基因組編輯和基因調(diào)節(jié)中的最常見(jiàn)并且最有力的工具。但是S.pyogenesCas9的活性一旦開(kāi)啟就無(wú)法關(guān)閉。那么如何減少S.pyogenesCas9過(guò)度激活或者長(zhǎng)時(shí)間活性帶來(lái)的基因編輯脫靶效應(yīng)，以及如何對(duì)S.pyogenesCas9的活性精確控制，是目前具有挑戰(zhàn)性的科學(xué)問(wèn)題。本研究首先利用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化出S.pyogenesCas9-的野生型和活性位點(diǎn)突變型蛋白，接著通過(guò)體外組裝和純化獲得S.pyogenesCa
5、s9-sgRNA以及S.pyogenesCas9-sgRNA-dsDNA復(fù)合物。在此基礎(chǔ)上，本研究從3000多種化合物中篩選得到12種能夠抑制S.pyogenesCas9活性的小分子抑制劑。并進(jìn)行了抑制劑抑制機(jī)制的研究，通過(guò)GST-Pulldown，EMSA實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其中包括CAS編號(hào)為107316-88-1、25535-16-4、34157-83-0、545-47-1、519-23-3和1617-53-4的6種小分子抑制劑通過(guò)抑制S.pyogenesCas9蛋白與DNA的結(jié)合發(fā)揮作用，而另外6種包括CAS編號(hào)為518058-84-9、48208-26-0、6902-91-6、2610-5-1、
6、1001645-58-4和137-66-6的小分子則通過(guò)不同的機(jī)制實(shí)現(xiàn)對(duì)S.pyogenesCas9蛋白活性的抑制作用。本研究提供能夠抑制S.pyogenesCas9的核酸酶活性的小分子抑制劑，有助于CRISPR/Cas9抑制劑的開(kāi)發(fā)，并且對(duì)CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)一步推廣有著重要意義。關(guān)鍵詞：S.pyogenesCas9；CRISPR/Cas9系統(tǒng)；蛋白純化；藥物篩選I哈爾濱工業(yè)大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractCRISPR/Cassystemsareadaptiveimmunesystemsevolvedbybacteriaandarchaea,Thewell-characteriz
7、edS.pyogenesCas9system,whichbelongstotypeII-ACRISPRsubtypeincludeCRISPRRNA(crRNA),transactivatingCRISPRRNA(tracrRNA)andCas9protein.ThesmallinvadingnucleicacidsinsertinCRISPRlocus,thenCRISPRlocustransc
