志賀菌多重耐藥的分子機制研究

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1、鄭州大學(xué)博士學(xué)位論文志賀菌多重耐藥的分子機制研究姓名：宋春花申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：流行病與衛(wèi)生統(tǒng)計學(xué)指導(dǎo)教師：段廣才20070530鄭州人學(xué)2007屆博十學(xué)位論文志賀菌多重耐藥的分子機制研究尚缺乏志賀菌從敏感株轉(zhuǎn)變?yōu)槎嘀啬退幹甑南到y(tǒng)的、全面的研究和評價資料，而本課題的設(shè)計立足于整體，從全基因組、蛋白質(zhì)組的角度研究志賀菌的耐藥機制。本課題以對多種抗生素敏感的志賀菌株為研究對象，采用抗生素次抑菌濃度自身誘導(dǎo)及接合基因轉(zhuǎn)移兩種方式，分別構(gòu)建多重耐藥菌株，通過抑制性消減雜交技術(shù)闡明志賀菌多重耐藥的核酸基礎(chǔ)：通過對志賀菌多重耐藥蛋白質(zhì)組學(xué)研究，從蛋白質(zhì)水平上闡明志賀菌多重耐藥相關(guān)蛋白

2、的種類及其作用：并綜合評價志賀菌在多重耐藥產(chǎn)生過程中獲得耐藥性的主要方式及其共存的耐藥機制，為志賀菌的分子流行病學(xué)監(jiān)測、研發(fā)新型抗菌藥物及指導(dǎo)臨床j下確使用抗生素提供科學(xué)依據(jù)。實驗方法1．最低抑菌濃度的測定以頭孢噻吩(cefalotin，CF)、諾氟沙星(norfloxacin，NOR)、慶大霉素(gentamycin，GM)、磺胺甲基異惡唑(cotrimoxazole，SMZ)四種抗生素為指示藥物，采用改良Kirby—Bauer法篩選臨床分離的福氏志賀菌敏感株和大腸埃希菌多重耐藥株，用瓊脂稀釋法測定抗菌藥物對志賀菌敏感株的最低抑菌濃度(minimalinhibitoryco

3、ncentration，MIC)。2．次抑菌濃度誘導(dǎo)實驗志賀菌敏感株在112MIC的抗生素LB培養(yǎng)基中連續(xù)12代培養(yǎng)，若誘導(dǎo)后MIC二一>4倍誘導(dǎo)前即為誘導(dǎo)多重耐藥菌株(以下簡稱誘導(dǎo)株)。3．接合轉(zhuǎn)移實驗以篩選出的志賀菌敏感株為受體菌，以多重耐藥大腸埃希菌為供體菌，在約4倍MIC抗生素濃度作用下進(jìn)行接合轉(zhuǎn)移構(gòu)建志賀菌基因轉(zhuǎn)移多重耐藥株(以下簡稱轉(zhuǎn)移株)。4．志賀菌多重耐藥抑制性消減雜交文庫的構(gòu)建采用抑制性消減雜交(suppressionsubtractivehybridization，SSH)實驗(1)采用細(xì)菌基因組提取試劑盒提取志賀菌敏感株、誘導(dǎo)株及轉(zhuǎn)移株的全基因組DNA，

4、以志賀菌敏感株基因組DNA為參照(Driver)，誘導(dǎo)株、轉(zhuǎn)移株基因組DNA為樣本(Tester)，Tester和Driver的DNA分別用同～種識別四堿基序鄭州人學(xué)2007屆博十學(xué)位論文志賀苗多重耐藥的分子機制研究列的限制性內(nèi)切酶Rsa1四堿基酶切獲得平均長度約600bpDNA片段。(2)將TesterDNA均分為兩份，分別接上接頭Adaptor1和Adaptor2R。接頭外側(cè)序列與第1次PCR引物序列相同，而內(nèi)側(cè)序列則與第2次巢式PCR引物序列相同，有利于后續(xù)PCR的篩選擴(kuò)增。此外接頭上含有T7啟動子序列及內(nèi)切酶識別位點，為以后克隆和測序提供方便。2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定連

5、接效率在25％以上，說明DNA片段與接頭連接效率較高。(3)兩輪消減雜交：用過量DriverDNA樣品分別與上述兩份連有接頭的TesterDNA樣品進(jìn)行第1次消減雜交。然后，混合上述兩份雜交樣品，同時加入新的變性DriverDNA進(jìn)行第2次消減雜交，這一次雜交進(jìn)一步富集了差異DNA。(4)兩次PCR反應(yīng)：加入根據(jù)接頭設(shè)計的引物進(jìn)行兩次PCR；第一次PCR基于抑制反應(yīng)，只有兩端連接有2個不同接頭的雙鏈DNA片段才能得到指數(shù)擴(kuò)增。第二次PCR實際上是巢式PCR，極大地提高了擴(kuò)增特異性，使目的基因片段得到大量富集。(5)消減效率的檢測：以經(jīng)消減雜交和未經(jīng)消減雜交第2輪PCR產(chǎn)物為模

6、板，23SrRNA5’和3’primers為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，評價消減效率。2％瓊脂糖凝膠電泳鑒定兩次PCR產(chǎn)物及消減效率。(6)將誘導(dǎo)及基因轉(zhuǎn)移多重耐藥抑制性消減雜交產(chǎn)物與pMDl8-T載體連接并轉(zhuǎn)化DH5a高效感受態(tài)細(xì)胞，克隆增殖，藍(lán)白斑篩選陽性克隆，并對全部陽性克隆30％甘油保存，構(gòu)建抑制性消減雜交文庫。5．志賀菌多重耐藥相關(guān)基因的篩選采用PCR技術(shù)分別對兩個消減雜交文庫中部分陽性克隆鑒定后利用斑點雜交對鑒定的陽性克隆PCR產(chǎn)物進(jìn)行篩選。對篩選到的多重耐藥相關(guān)基因用M13雙向引物測序，并將測序結(jié)果在BLAST上進(jìn)行同源性比對。6．志賀菌多重耐藥的蛋白質(zhì)組學(xué)分析(1)應(yīng)

7、用雙向電泳(two—dimensionalelectrophoresis，2-DE)技術(shù)比較志賀菌多重耐藥株與敏感株的全菌蛋白表達(dá)譜。采用超聲兼Urea．CHAPS．DTT裂解提取法制備志賀菌敏感株、誘導(dǎo)株、轉(zhuǎn)移株全菌蛋白，Bradford法蛋白定量。(2)將提取的三種菌株的100pg全菌蛋白在IPGphor水平電泳儀上進(jìn)行第一鄭州大學(xué)2007屆博十學(xué)位論文：占賀苗多重耐鰣的分子機制研究相等電聚焦，然后在含有DTT和碘乙酰胺的平衡液中分別平衡15mira轉(zhuǎn)移到第-kllSDS．PAGE凝膠，在恒功率(1