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1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)自殺基因抑制移植靜脈內(nèi)膜增生的實驗研究姓名：羅濤申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：外科學(xué)指導(dǎo)教師：張強(qiáng)2002.9.1腺病毒介導(dǎo)的轉(zhuǎn)自殺基因抑制移植靜脈內(nèi)膜增生的實驗研究中文摘要目的動脈粥樣硬化常導(dǎo)致心血管和肢體血管狹窄或閉塞，有較高的致死、致殘率，嚴(yán)重威脅患者的健康。自體靜脈移植，重建動脈循環(huán)通路，是經(jīng)典的治療手段，可以有效地減輕癥狀、延長生命。但是靜脈移植物在術(shù)后易形成新生內(nèi)膜，使其在術(shù)后10年約有40％“0％發(fā)生狹窄和堵塞。提高移植靜脈術(shù)后通暢率成為血管外科亟待解決的問題。目前研究表明，移植靜
2、脈狹窄的主要原因是移植靜脈內(nèi)膜增生，內(nèi)膜增生是血管平滑肌細(xì)胞增生遷移的結(jié)果。抑制平滑肌細(xì)胞增生成為防治移植靜脈狹窄的焦點。藥物治療移植靜脈狹窄很不理想，往往因為系統(tǒng)給藥毒副作用大而在臨床上受到限制。現(xiàn)在隨著基因技術(shù)的發(fā)展，基因治療成為解決這一難題的希望。自殺基因系統(tǒng)最早應(yīng)用在腫瘤的治療中，取得了較好的效果。在動脈損傷再狹窄的研究中，轉(zhuǎn)染自殺基因TK可顯著地抑制平滑肌細(xì)胞增生，減輕新生內(nèi)膜造成的血管腔狹窄，但縱觀文獻(xiàn)，自殺基因的在靜脈系統(tǒng)中的作用如何，尚未見報導(dǎo)。針對細(xì)胞增生為特點的病理改變，本實驗擬采用自殺基因系統(tǒng)抑制移植靜脈
3、內(nèi)膜增生。方法本實驗采用大隱靜脈培養(yǎng)和大鼠靜脈移植作為實驗?zāi)Ｐ停M內(nèi)膜增生病理變化。實驗中首先應(yīng)用腺病毒載體攜帶標(biāo)記基因LacZ，研究大隱靜脈和大鼠移植靜脈中轉(zhuǎn)基因的效率、靶細(xì)胞和表達(dá)時效。然后以TK基因為治療基因，以腺病毒為載體轉(zhuǎn)染人及大鼠的靜脈，在培養(yǎng)液或大鼠體內(nèi)注人丙氧鳥苷，觀察靜脈內(nèi)膜是否受到顯著的抑制。體外轉(zhuǎn)基因：將靜脈剖開，內(nèi)膜暴露，自然浸入病毒載體溶液中。然后將靜脈橫斷成0．5cm的片斷，隨機(jī)分到各組，將靜脈片置于培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，隔日換培養(yǎng)液，培養(yǎng)至取材。為提高中膜平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)染率，本實驗探討了機(jī)械牽拉、靜脈腔
4、內(nèi)灌注轉(zhuǎn)基因的方法。在體轉(zhuǎn)基因：Wister大鼠經(jīng)腹腔麻醉后，取頸部中線切i]，暴露頸靜脈及其分枝。用顯微血管夾鉗夾頸靜脈的兩端，微量注射器從靜脈側(cè)枝的橫斷切口插入。靜脈管腔用RPMll640的肝素水輕輕沖洗去殘留血。病毒液注入管腔，使其充盈。室溫下孵育30分鐘后。對照組松鉗后恢復(fù)靜脈的血流。實驗組則將頸靜脈進(jìn)行結(jié)扎，切除，作為移植物進(jìn)行頸動脈問位移植術(shù)。移植術(shù)后3，14，21天取標(biāo)本。以相同條件在靜脈中轉(zhuǎn)染自殺基因TK。標(biāo)本處理：培養(yǎng)的大隱靜脈片或移植的頸靜脈，經(jīng)常規(guī)處理后切片，進(jìn)行蘇木素一伊紅(HE)染色、Verhoeff
5、彈力纖維染色(VG)，輔以計算機(jī)圖像分析觀察內(nèi)膜增生程度。進(jìn)行PCNA免疫組織化學(xué)染色，測定平滑肌細(xì)胞增生指數(shù)。大隱靜脈常規(guī)石蠟切片，行抗內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)Ⅷ因子及平滑肌細(xì)胞d一肌動蛋白免疫組織化學(xué)染色，鑒定靜脈中細(xì)胞成分，以掃描電鏡觀察靜脈的通透性變化。靜脈組織經(jīng)X—gal染色檢測靜脈中基因轉(zhuǎn)染及表達(dá)效率，并對陽性細(xì)胞種類進(jìn)行鑒別。取3天時的大鼠頸靜脈進(jìn)行ICAM一1，VCAM一1免疫組化染色，觀察移植靜脈炎性改變。測定各時點大鼠轉(zhuǎn)基因靜脈中8一半乳糖酶活性。以原位雜交和PCR為手段鑒定轉(zhuǎn)TK基因成功并且表達(dá)。測定心、肺和腦等重要
6、臟器的半乳糖酶活性和自殺基因的存在。結(jié)果實驗中觀察到腺病毒載體的靶細(xì)胞廣泛，大隱靜脈的內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞均可被轉(zhuǎn)染。內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染率與腺病毒載體作用的時間長短有關(guān)，10rain即可轉(zhuǎn)染上標(biāo)記基因，較長的孵育時間可獲得較高的轉(zhuǎn)基因效率。中膜的平滑肌細(xì)胞也可被腺病毒載體轉(zhuǎn)染，但轉(zhuǎn)染率較低。為提高中膜平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因效率，本實驗使用機(jī)械牽拉及灌注加壓的方法，使中膜平滑肌細(xì)胞的轉(zhuǎn)基因效率明顯提高，同時實驗表明，內(nèi)皮細(xì)胞并未因此而受到損傷。實驗中對大鼠移植靜脈及正常靜脈轉(zhuǎn)染腺病毒介導(dǎo)的B一半乳糖酶基因，然后在3，14和21天后測定半乳
7、糖酶的活性。3天后，腺病毒有效地轉(zhuǎn)染內(nèi)皮細(xì)胞及中膜平滑肌細(xì)胞。轉(zhuǎn)基因的移植靜脈與轉(zhuǎn)基因的正常靜脈相比較，移植靜脈內(nèi)皮細(xì)胞大量表達(dá)VCAM一1，ICAM一1，炎性反應(yīng)明顯?！?·移植靜脈中半乳糖酶的活性為正常靜脈的70％，其活性下降明顯。第14天時，所有靜脈ss夕t．源基因表達(dá)效率都降低，在移植靜脈中更為明顯，與正常靜脈相比差異顯著。在術(shù)后2l天，所有靜脈中均無半乳糖酶活性表達(dá)。移植靜脈中的內(nèi)皮細(xì)胞容易受到動脈血流及炎性反應(yīng)的影響，陽性細(xì)胞損失明顯，這是半乳糖酶活性降低的一個重要原因。中膜的平滑肌細(xì)胞由于受到解剖屏障的保護(hù)．陽性
8、細(xì)胞損失率并不顯著。中膜平滑肌細(xì)胞轉(zhuǎn)基因藉可較長時間穩(wěn)定地表達(dá)外源基因。培養(yǎng)靜脈及移植靜脈14天時，內(nèi)膜明顯增厚，此時平滑肌細(xì)胞增殖最為顯著。通過PCR及原位雜交證明腺病毒叼以將胸苷激酶基因轉(zhuǎn)染人的大隱靜脈及大鼠自體移植靜脈并能夠表達(dá)mRNA，在對照組中轉(zhuǎn)半乳糖酶基因的靜脈中
