Notch信號(hào)通路在腹膜透析相關(guān)的大鼠腹膜纖維化中的作用研究

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1、中山人學(xué)博}j學(xué)位論義Notch信0通路和腹膜透析豐

2、1關(guān)的人鼠腹膜纖維化中的作用研究Notch信號(hào)通路在腹膜透析相關(guān)的大鼠腹膜纖維化中的作用研究博士研究生：朱風(fēng)新導(dǎo)專師：聶靜教授業(yè)：內(nèi)科學(xué)中文摘要腹膜透析治療終木期腎臟疾病已有30余年的歷史，現(xiàn)在已經(jīng)有越來越多終末期腎臟病(endstagerenaldisease，ESRD)患者接受腹膜透析治療。與血液透析相比，透析的前l(fā)一2年內(nèi)在總體生存率方面腹膜透析是占優(yōu)勢(shì)的，但是隨著透析時(shí)間的延長，大約50％的病人因?yàn)槌瑸V衰竭在4—5年內(nèi)退出腹膜透析。目前的研究表明，隨著插管技術(shù)的改進(jìn)，感染率的下

3、降，腹膜纖維化導(dǎo)致的超濾功能喪失已經(jīng)成為長期腹膜透析患者退出的主要原因。腹膜是一種生理性的半透膜，表面覆蓋著一層扁平的腹膜fHJ皮細(xì)胞，問皮細(xì)胞下有結(jié)締組織、少數(shù)成纖維細(xì)胞和豐富的毛細(xì)血管。以往認(rèn)為固有的問質(zhì)成纖維細(xì)胞及炎癥細(xì)胞是造成腹膜纖維化的主要細(xì)胞，而間皮細(xì)胞僅僅是腹膜損傷的受害者，但是近來的研究發(fā)現(xiàn)，長期非生物相容性腹膜透析液的刺激可以導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生向問充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化。轉(zhuǎn)分化的間皮細(xì)胞具有肌成纖維母細(xì)胞的特性，其遷移能力和侵襲性顯著增強(qiáng)，并且分泌VEGF,從而在腹膜纖維化及血管增生中發(fā)揮作用。因此，腹膜問皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化是腹

4、膜透析患者腹膜功能逐漸降低的關(guān)鍵因素之一。Notch信號(hào)通路是一條保守的信號(hào)傳導(dǎo)途徑，廣泛表達(dá)于從無脊椎動(dòng)物到脊椎動(dòng)物等多個(gè)物種。Notch信號(hào)通路由受體、配體和DNA結(jié)合蛋白3部分構(gòu)成。相鄰細(xì)胞上的受體和配體結(jié)合后導(dǎo)致受體構(gòu)象改變暴露出蛋白水解酶的酶切位點(diǎn)，并經(jīng)隨后2次蛋白水解作用釋放出具有核定位信號(hào)的胞內(nèi)段(Notch中山人學(xué)博I：學(xué)化論義Notch信吁通路4：腹膜透析相關(guān)的人鼠腹膜纖維化中的作用刖f究intracellulardomain，NICD)，從而轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi)，激活下游革巴基因，參與調(diào)控細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。在上述Not

5、ch信號(hào)通路的活化過程中，受體的最后一步蛋白水解作用至關(guān)重要，在丫一分泌酶(1，．Secretase)的作用下直接釋放出具有活性的NICD。實(shí)驗(yàn)證實(shí)Y．分泌酶抑制荊(丫一SecretaseInhibitor，GSI)可以通過其特異性的抑制丫．分泌酶的作用，減少NICD的釋放，從而抑制Notch通路的活化。目前在哺乳動(dòng)物中已發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路4種同源受體：Notchl一4，5種同源配體：Delta-l、Delta一3、Delta-4、Jagged一1、Jagged一2和兩類下游靶基因：Hes和Hey家族。研究發(fā)現(xiàn)Notch信號(hào)通路與神經(jīng)

6、干細(xì)胞、肺、胰腺、腎、軟骨以及前列腺的分化發(fā)育密切相關(guān)。近年來的研究更發(fā)現(xiàn)異常活化的Notch信號(hào)作為致癌岡素或抑癌因素與多個(gè)系統(tǒng)的腫瘤發(fā)生相關(guān)。隨著研究的深入，進(jìn)一步證實(shí)Notch信號(hào)通路在生物體的生長發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中所起的作用與其觸發(fā)EMT有關(guān)。但是，在腹膜組織中是否存在Notch信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)，Notch信號(hào)通路是否也在腹膜問皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的過程發(fā)揮作用?尚未見報(bào)道。因此本實(shí)驗(yàn)的目的是闡明Notch信號(hào)通路在腹膜纖維化中的作用和機(jī)制，探討抑制Notch信號(hào)活化對(duì)腹膜纖維化進(jìn)程的影響，為腹膜透析相關(guān)的腹膜纖維化的治療

7、提供新的靶點(diǎn)。第一部分觀察Notch信號(hào)通路在高濃度葡萄糖腹膜透析液所致大鼠腹膜纖維化模型中的變化一、目的構(gòu)建大鼠腹膜纖維化模型，觀察在大鼠腹膜纖維化過程中Notch信號(hào)通路的變化。二、方法18只清潔級(jí)健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、2周模型組和4周模型組，2周和4周模型組每同腹腔注射4．25％葡萄糖透析液100ml／kg，并分別于連中山大學(xué)博士學(xué)位論文Notch信號(hào)通路在腹膜透析相關(guān)的大鼠腹膜纖維化中的作用研究續(xù)注射14天和28天后殺檢大鼠，行腹膜平衡實(shí)驗(yàn)，準(zhǔn)確量取腹腔內(nèi)流出液體，留取0、4小時(shí)血清和腹腔流出液標(biāo)本，計(jì)算葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量

8、，并分別留取壁層和臟層腹膜組織。HE和Masson染色觀察壁層腹膜病理變化；超濾量和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)量反映腹膜功能；Westernblot檢測(cè)臟層腹膜組織中0【一SMA、E．cadherin和CollagenI的蛋白表達(dá)的變化；同時(shí)采用Westernblot檢測(cè)臟層腹膜組織中TGF一131蛋白的表達(dá)；使用RT-PCR檢測(cè)Notch信號(hào)通路的各種受體、配體及下游靶基因的mRNA在臟層腹膜組織中的表達(dá)情況，并進(jìn)一步使用Westernblot和組織問接免疫熒光的方法觀察臟層腹膜組織中Notch信號(hào)通路配體Jagged—l、Notch信號(hào)通路受體Not

9、ch．1以及Notch信號(hào)通路的下游靶基因Hes．1的蛋白水平的變化。采用Westernblot檢測(cè)Notch信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子Numb的蛋白水平的變化。三、結(jié)果HE染色顯示模型組壁層腹膜