單鏈莫奈林基因表達載體的構(gòu)建及其在畢赤氏酵母中的表達

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1、江西農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文單鏈莫奈林基因表達載體的構(gòu)建及其在畢赤氏酵母中的表達姓名：艾華水申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：動物遺傳育種與繁殖指導(dǎo)教師：黃路生;袁漢英2002.10.1江西農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要天然的莫奈林是從西非植物Dioscoreophyllumcummin．s'ii的漿果中分離出的，甜度非常高的一種蛋白質(zhì)，它由兩條彼此分離的多肽鏈(A鏈和B鏈)通過氫鍵和疏水作用力結(jié)合在一起，A鏈含有45個氨基酸殘基，B鏈含有50個氨基酸殘基。在等摩爾質(zhì)量下，雙鏈莫奈林的甜度約為蔗糖的100，000倍，約為二肽甜昧劑aspa

2、rtame的300倍。由于雙鏈莫奈林在高溫下不穩(wěn)定，且pH的耐受性不強，易失去甜味，單鏈莫奈林(Single．Chainmonellin，SCM)通過基因工程改造應(yīng)運而生，它是在不改變其拓撲結(jié)構(gòu)和甜味活性的前提下，兩條多肽鏈被融合在一起。單鏈莫奈林具有更高的耐熱和耐酸性，更加穩(wěn)定。根據(jù)甜蛋白莫奈林的氨基酸序列，選擇畢赤氏酵母偏愛的密碼子，用化學(xué)合成法合成單鏈莫奈林基因片段，并拼接成完整基因?？寺『笮蛄蟹治霰砻?，合成的單鏈莫奈林基因與設(shè)計的保持一致。將單鏈莫奈林基因裝載到大腸桿菌質(zhì)粒pUCl18、pBSKS+年I]畢赤氏

3、酵母整合型質(zhì)粒pPIC9K，構(gòu)建了畢赤氏酵母單鏈莫奈林基因表達載體pPIC9K／SCM。利用BglII酶酶切構(gòu)建好的表達載體pPIC9K／SCM，形成線性化的表達單元，經(jīng)電轉(zhuǎn)化、RDB缺陷培養(yǎng)和G418抗性平板篩選后，獲得了其表達單元整合在酵母基因組中的轉(zhuǎn)化重組子(即重組菌株)，其中有3個抗G418的水平達到4mg／ml；轉(zhuǎn)化重組子得到PCR的驗證。通過表達測試，得到一個表達水平較高的重組子。經(jīng)誘導(dǎo)表達，SDS—PAGE顯示在約11～12KD處有一條明顯的蛋白條帶。表達產(chǎn)物純化后，SDS．PAGE檢測發(fā)現(xiàn)有兩條帶，且分

4、子量較大的約為較小的兩倍：這個結(jié)果提示，表達產(chǎn)物在某些溶劑中可能以兩種形式——單體和二聚體存在。通過搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵，表達產(chǎn)物的含量占發(fā)酵上清液總蛋白的46．9％，其濃度為2．12mg／ml，產(chǎn)量為11．07mg／g濕菌。經(jīng)等電薄層凝膠電泳檢測，表達產(chǎn)物的pI約為9．4。關(guān)鍵詞：單鏈莫奈林，畢赤氏酵母，分泌表達單鏈莫奈林基因表達載體的構(gòu)建及其在畢赤氏酵母中的分泌表達AbstractThesweetprotein，monellin，wasoriginallyisolatedfromtheberriesofthewestAfr

5、icanplantDioscoreophyllumcurnminsiiNativemonellinconsistsoftwoseparatepolypeptidechains，a45一residueA—chainanda50-residueB‘chainThetwochainsarepackedcloselybybothintermolecularhydrogenbondsandhydrophobicinteractions．Two—chainmonelliniS～100．000timessweeterthansucr

6、oseand-300timessweeterthanthedipeptidesweeteraspartameonamolarbasis．Two·chainmonellinisunstableathightemperatures，andlosessweetness．Anengineeredsingle-chainmonellin(SCM)，constructedbyfusingthetwochainswithoutdisruptingitstopologyandsweetactivity，hasbeenprovenmor

7、estableandsweetthanthetwo—chainmonellinunderbothhightemperatureandacidicconditions．Accordingtotheaminoacidsequenceofthesweetproteinmonellin，asingle-chainmonellin(SCM)geneissynthesizedusingPichiaPastorisbiasedcodonsbythechemicalsynthesismethodofoligonucleotidefra

8、gment．ItshowsthatthesynthesizedSCMgeneisaccordantwiththeexpecteddesignthroughtheresultofsequenceanalysis．TheSCMgoneisligatedintotheEcoilvectorsofpUCl18，pBSKS+andthePi