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《(醫(yī)藥衛(wèi)生)層析分離純化技術(shù)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、層析分離純化技術(shù)2001.11.28ShanghaiPudong1蛋白質(zhì)純化策略融合蛋白質(zhì)非融合蛋白質(zhì)表達(dá)簡(jiǎn)單純化一步親和層析90-97%純度更高純度三步純化策略粗提中度純化精細(xì)純化多步純化2簡(jiǎn)易純化選擇載體和標(biāo)記純化pGEX谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶GSTMicroSpin?PurificationModule,GSTrap?,GlutathioneSepharose?FastFlowPQE 6x組氨酸HisMicroSpinPurificationModulepETHisTrap?,HiTrap?Chelating,
2、6x組氨酸ChelatingSepharoseFastFlowpEZZ18(非誘導(dǎo)性表達(dá)) 蛋白A的IgG結(jié)合區(qū)IgGSepharose6FastFlowpRIT2T(利用溫度改變誘導(dǎo))蛋白A的IgG結(jié)合區(qū)IgGSepharose6FastFlow3GST融合蛋白的純化GST重組蛋白酶切位點(diǎn)FactorXa:Mr17-20000/28-30000Thrombin:Mr37000PreScission?Protease:Mr46000GlutathioneSepharose?Mr2600010C4任何規(guī)模純化都比較簡(jiǎn)
3、單預(yù)裝柱/填料一次可純化GST注意 融合蛋白的量GSTMicroSpin?〈400μg立即可用,預(yù)裝柱,PurificationModule緩沖液和試劑和MicroPlex?24Vacuum結(jié)合使用可以大大增加處理量 (一次處理〈48樣品)GSTrap?1ml10-12mg立即可用,預(yù)裝柱GSTrap5ml50-60mg立即可用,預(yù)裝柱GlutathioneSepharose?4B8mg/ml可自行裝柱GlutathioneSepharose410-12mg/ml可自行裝柱，使用層析系統(tǒng)快速純化，F(xiàn)astFlow適
4、合放大5GSTMicroSpin?PurificationModule立即可用,50預(yù)裝柱含緩沖液和所需試劑可純化每柱400μg,體積達(dá)400μl樣品適合蛋白質(zhì)擴(kuò)增系統(tǒng)篩選和優(yōu)化，小規(guī)模純化6GSTrap?柱20分鐘內(nèi)每1ml柱12mg或每5ml柱60mg使用針筒，蠕動(dòng)泵，或者?KTA?系統(tǒng)添加劑兼容適合快速和重復(fù)性高的要求7GSTrap?結(jié)合緩沖液平衡加樣后用結(jié)合緩沖液沖洗廢液收集用洗脫緩沖液洗脫收集組份3min5-15min2min8GSTrap?SDSPAGEanalysis020406080100%Elut
5、ionbuffer00.51.01.52.02.53.03.55.010.015.020.0mlminWashElutionbuffer2.7mgpureGSTfusionprotein5.010.015.020.0A280kD9414.420.1304367123柱:GSTrap1ml樣品:8ml大腸桿菌表達(dá)含GST融合蛋白胞漿萃取液結(jié)合緩沖液:PBS,pH7.3洗脫緩沖液50mMTris?-HCl,pH8.0＋10mM還原谷胱甘肽流速:1ml/min層析 步驟:4CV結(jié)合緩沖液,8ml樣品,10CV結(jié)合緩沖液,
6、 5CV洗脫緩沖液,5CV結(jié)合緩沖液(CV=柱體積)系統(tǒng):?KTA?explorer101:低分子量標(biāo)記(LMW)Calibrationkit,還原,AmershamPharmaciaBiotech2:胞漿萃取液,1g/10ml3:洗脫GST融合蛋白9GlutathioneSepharose?FastFlow適合裝填在高效層析柱中和層析系統(tǒng)結(jié)合使用，并用作放大每毫升填料可以純化12mg融合蛋白裝在XK空柱中和?KTA?平臺(tái)純化系統(tǒng)連接使用高流速兼容尿素，鹽酸胍等10GST融合蛋白的檢測(cè)檢測(cè)方法注意GST96孔板EL
7、ISA檢測(cè)試劑盒適合篩選表達(dá)系統(tǒng)和層析組份當(dāng)表達(dá)蛋白的含量不明或需要高靈敏度時(shí)特別有用GST酶測(cè)定檢測(cè)模組快速測(cè)定；適合篩選用途功能測(cè)定可以有效評(píng)估純化出來(lái)的GST融合蛋白的活性，但可能需要自行設(shè)計(jì)和優(yōu)化11GST融合蛋白的檢測(cè)檢測(cè)方法注意使用抗-GST抗體和高度特異,只檢測(cè)GST融合蛋白ECL?檢測(cè)系統(tǒng)的使用適當(dāng)濃度的二級(jí)HRP標(biāo)記抗體可以免疫印跡法使背景大大減低，甚至去掉ECL檢測(cè)系統(tǒng)提高免疫印跡的檢測(cè)能力ECL提供大部分重組表達(dá)應(yīng)用所需的靈敏度 需要更高靈敏度時(shí)使用ECLPlus.SDS-PAGE＋Cooma
8、ssie?提供分子量大小和%純度訊息. 考馬氏染色或銀染可檢測(cè)融合蛋白和污染物.12GST96-孔板ELISA檢測(cè)試劑盒快速酶測(cè)定每塊板可檢測(cè)50樣品適合篩選表達(dá)系統(tǒng)和層析組份13(His)6融合蛋白的純化和檢測(cè)重組蛋白HisHisHisNi2+HisHisHisHisNi2+Ni2+Ni2+14任何規(guī)模純化都比較簡(jiǎn)單預(yù)裝柱/填料一次可純化注意 融合蛋白的量
