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《刺槐無性系轉(zhuǎn)化體系的建立及液泡型NaH逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
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2、簽名：導(dǎo)師簽名：日期：2QQ6：巨：29山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文中文摘要刺槐∞D(zhuǎn)6加?jì)D雄砌∞∞塒是一種多用途豆科固氮樹種(觀賞、木材、飼料、蜜源樹種)，它生長快，材質(zhì)好，因此已成為人工造林的首選樹種。但其有限的耐鹽能力卻限制著其栽種范圍，利用基因工程手段對(duì)其耐鹽性進(jìn)行改造是一條重鹽堿地區(qū)發(fā)展刺槐林的重要途徑。Na+在液泡內(nèi)區(qū)隔化的關(guān)鍵因子液泡膜N謝逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因是植物耐鹽基因工程的關(guān)鍵因子，本工作在建立刺槐優(yōu)良無性系高效再生體系的基礎(chǔ)上，利用天然的植物轉(zhuǎn)基因系統(tǒng)一根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)，在35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下，將來自于苜
3、蓿的抗鹽基因肱訂哂叼導(dǎo)入刺槐離體葉片。同時(shí)對(duì)刺槐液泡膜Na+／一逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因進(jìn)行了克隆并對(duì)其功能進(jìn)行了初步分析。試驗(yàn)選用的刺槐無性系為84053，利用其嫩莖、葉片和刺槐種子萌發(fā)后獲得的子葉、下胚軸和幼胚作為外植體，分別研究愈傷組織形成與芽再生能力。嫩莖為外植體時(shí)，33．3％外植體產(chǎn)生了不定芽，每個(gè)外植體產(chǎn)生不定芽個(gè)數(shù)為2．3個(gè)；子葉培養(yǎng)中，40％的外植體形成愈傷組織，形成愈傷組織的速度慢，而且只有50％愈傷分化出1．2個(gè)芽；下胚軸培養(yǎng)中，7d就可以在下胚軸的兩端產(chǎn)生大量愈傷并出現(xiàn)芽分化，平均1個(gè)外植體分化5個(gè)
4、芽，有的可達(dá)7．8個(gè)芽；葉片培養(yǎng)中采用兩步法，平均每塊分化愈傷塊產(chǎn)生的有效嫩梢(大于1．Ocm)數(shù)量可達(dá)12個(gè)，該再生體系能夠滿足基因轉(zhuǎn)化的需要，可以用于該刺槐無性系的遺傳轉(zhuǎn)化。試驗(yàn)對(duì)TDZ(砸di蛐0n1在刺槐離體葉片再生芽誘導(dǎo)中的作用進(jìn)行了研究，結(jié)果表明在附加2ml；／uDz與0．1mg幾NAA的培養(yǎng)基上芽再生效率最高，平均每塊外植體產(chǎn)生15個(gè)不定芽，且TDz濃度越高，產(chǎn)生不定芽的數(shù)量越多。但是隨著Ⅱ)z含量的增加，同時(shí)產(chǎn)生過多的愈傷組織，使再生芽不能正常伸長生長，試管苗玻璃化，并抑制芽的伸長生長。通過將再生
5、芽轉(zhuǎn)移到含有少量Ⅱ)z0．05mg，L，同時(shí)添加BAO．5mg，L、MAAO．01mg幾的培養(yǎng)基上進(jìn)行繼代培養(yǎng)，較好的解決了這一問題。根據(jù)分化根的數(shù)量和長度確定添加O．5mg／LmA的培養(yǎng)基可以最好地誘導(dǎo)剌槐試管苗根的分化。選用離體無菌葉片為外植體對(duì)苜蓿^說耵同源基因進(jìn)行轉(zhuǎn)化，獲得了抗性芽。遺傳轉(zhuǎn)化過程如下：取新展開的試管苗幼嫩葉片接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)7d，用攜帶?？果}基因ⅣH，的農(nóng)桿菌菌株Gv310l浸染葉片刺槐無性系轉(zhuǎn)化體系的建立及液泡型Na-／lr逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的克隆8．12miⅡ，然后放置到誘導(dǎo)培養(yǎng)
6、基上共培養(yǎng)2-3d，除菌后，移入篩選培養(yǎng)基MSB5s+TDZ2mg，L+NAAo．1mg／L+頭孢霉素(Cef)400mg／L+50mg幾卡那霉素(1渤)預(yù)篩選30d，得到抗性愈傷。將抗性愈傷轉(zhuǎn)到芽伸長附加BA0．5mg幾，NAAO．Olm嘰以及Ccf400m舡和25mg／LKan上的MSB5S培養(yǎng)基，最后得到3個(gè)抗性芽。但是，抗性芽轉(zhuǎn)到含O．5m以mA的抗性生根培養(yǎng)基上，一直未能生根。以鹽刺激后的植株幼根為材料，對(duì)刺槐液泡膜Na饑r逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白同源基因進(jìn)行克隆。通過比較G曲BaIll【中己登錄的多種植物液泡膜N
7、a+／礦逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的氨基酸序列和核甘酸序列，根據(jù)保守序列設(shè)計(jì)一對(duì)簡并引物，通過RT-PcR從刺槐中擴(kuò)增出一315bpcDNA中間片段，根據(jù)此片段序列設(shè)計(jì)3’端特異引物，利用3tRACE得到576bp的3’端cDNA片段。根據(jù)3’端片段序列設(shè)計(jì)5’端特異引物，得到746bp的5’端cDNA片段。該基因命名為母刪(RD6加缸蘆P砌口∞c缸翮)，并在G皿Ba玎1【進(jìn)行了登記，登記號(hào)為AY652727。用DNAM^N軟件對(duì)獲得的基因序列分析顯示，砌腳編碼的蛋白質(zhì)含有491個(gè)氨基酸，與G∞Bank中的序列進(jìn)行同源比較發(fā)現(xiàn)
8、，其氨基酸序列與多種植物的液泡型Na?，時(shí)逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有較高的同源性，其中與苜蓿的同源性最高，達(dá)87％，其次與毛白楊、棉花、擬南芥、濱黎的同源性均為76％，而與水稻0sNHA1、擬南芥AtsOSl和AlNHx8三個(gè)質(zhì)膜型NaⅥ{+逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的序列同源性非常低，分別約為24％，28％和25％。說明肋腳可能是液泡型N礦／礦逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白擬南芥^堿船的同源基因。關(guān)鍵詞：刺槐；
