《轉(zhuǎn)基因擬南芥培養(yǎng)》PPT課件

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1、GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥的培養(yǎng)及熒光觀察GFP報告基因發(fā)現(xiàn)：綠色熒光蛋白（Greenfluorescentprotein，GFP）水母中發(fā)現(xiàn)發(fā)光蛋白（20世紀(jì)60年代）GFP報告基因性質(zhì)：238氨基酸組成的單鏈多肽在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光有什么用呢?蛋白質(zhì)在活細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位及動態(tài)變化觀察（分泌蛋白的分選、亞細(xì)胞定位）目的基因目的基因tubulin擬南芥葉片表皮細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞中微管骨架的分布情況根部細(xì)胞目的基因與載體簡介pGMAP65-1::GFP植物表達(dá)載體的構(gòu)建?導(dǎo)入農(nóng)桿菌自我復(fù)制?浸染花

2、粉轉(zhuǎn)入擬南芥導(dǎo)入成功?轉(zhuǎn)染成功?tubulin如何判定載體轉(zhuǎn)化成功，植株內(nèi)是否有目的基因的表達(dá)？——載體及植株的篩選卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選卡那霉素:抗生素影響植物細(xì)胞葉綠體和線粒體的蛋白合成,引起植株黃化死亡.卡那霉素能對轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選實(shí)質(zhì)上是通過卡那霉素抗性基因起作用的。轉(zhuǎn)基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素,轉(zhuǎn)化體就很容易從非轉(zhuǎn)化體中篩選出來。卡那培養(yǎng)基上篩選GFP轉(zhuǎn)基因幼苗生長一個月左右的GFP轉(zhuǎn)基因植株體式熒光顯微鏡觀察GFP轉(zhuǎn)基因植株生長兩個月左

3、右的GFP轉(zhuǎn)基因植株Confocal熒光顯微鏡觀察GFP-tubulin在氣孔保衛(wèi)細(xì)胞中的定位材料與試劑材料：GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥種子及幼苗試劑：MS培養(yǎng)基(wildtype)；MS卡那抗性培養(yǎng)基(GFP-MAP65)；75％乙醇；10％NaClO；無菌水。種子消毒及播種實(shí)驗(yàn)流程種子春化（加蒸餾水放入4℃冰箱中過夜）；75％乙醇潤洗一遍，再用75％酒精消毒1min（混勻，盡量將液體吸凈，動作要快）；10％NaClO潤洗一遍，再用10％NaClO消毒10min（混勻，盡量將液體吸凈，動作要快）；無菌

4、水洗五遍，用牙簽將種子點(diǎn)在培養(yǎng)基表面（每皿4-5顆種子盡量均勻）；封膜，做好標(biāo)記，平放于培養(yǎng)架上培養(yǎng)。注意事項(xiàng)：嚴(yán)格無菌操作！消毒過程動作要快！槍頭不要重復(fù)使用，物品不要拿出超凈臺！點(diǎn)種時每個位置盡量只點(diǎn)一顆種子！操作時盡量避免說話和人員走動！注意小組內(nèi)的配合和小組間的協(xié)調(diào)！