擬南芥轉(zhuǎn)基因注意事項一.doc

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1、擬南芥轉(zhuǎn)基因注意事項一By?aqiao發(fā)表于2009-2-2718:39:00?1推薦材料選擇：擬南芥中最常見的3種生態(tài)型(Columbia、Landsberg、Wassilewskija)的野生型Columbia基因組信息已測。?擬南芥最適溫度是23度左右培養(yǎng)基可以直接用MSph7.0左右擬南芥轉(zhuǎn)到光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)長勢會好些種子消毒：擬南芥的經(jīng)典表面消毒程序是：70％酒精1－5min，10％次氯酸鈉15min，無菌水徹底漂洗5次。酒精30秒足夠了外加10%~15%漂白液1分半也足夠了保持光照150mm以上如果不是在培養(yǎng)皿中萌發(fā)種子的話，而是在小的pots里萌發(fā)的

2、，切記上面蓋germinationdome或者用保鮮膜包好，不過要做好通風措施?溫度和光照都很重要!也可以這樣：75%的消毒一分鐘，70%的再消毒兩次1分鐘，這樣足以。擬南芥的生長條件，最好是，長日照，60-70%的濕度，22攝氏度左右。光照要夠。溫度25左右,光照要充足.轉(zhuǎn)化實驗　　選取飽滿的擬南芥種子，種在花盆中，置于短日照（10h以下）溫室中培養(yǎng)3周后轉(zhuǎn)放到長日照條件下（光照12h以上）誘導抽苔開花。開花時用剪刀切去蓮座葉以上主花軸（此時植株高約10cm），以促進次生花軸抽苔。剪切后7～9　d用作轉(zhuǎn)化實驗(此時植株高約10～15　cm,最大花序已產(chǎn)生第1個角

3、果,轉(zhuǎn)化實驗前一天停止?jié)菜?。作轉(zhuǎn)化實驗時，用抽真空方法［6］將含有GUS基因和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因的載體轉(zhuǎn)入擬南芥的花序中。也可用其它抗生素抗性基因作為選擇標記。鑒于一般實驗室不具備自制基因載體的條件，建議向有條件的實驗室索取。操作過程是：（1）將含有載體的土壤農(nóng)桿菌接種在含卡那霉素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600　nm為1.2～1.8。(2)將培養(yǎng)物分裝在400ml的燒杯中，置于真空罐中抽真空至培養(yǎng)液冒泡為止。(3)將上述準備好的擬南芥植株倒插入培養(yǎng)液中，確保所有的花都浸在農(nóng)桿菌培養(yǎng)液中，蓮座葉與培養(yǎng)液之間距離2cm，抽真空0.5h。(4)將植株連同花盆取出，用塑料

4、袋套住，并封口，側(cè)放在培養(yǎng)室中。2d后花盆直立，去掉塑料袋；生長約4周時角果變黃，再用紙袋將植株套住，側(cè)放；1周后剪下植株，收種子，干燥1周后放到4℃的冷室中。2d后將種子放在含有50mg.L－1卡那霉素的MS培養(yǎng)基上，生長約1周，凡是轉(zhuǎn)化的植株，其葉片大而綠，未轉(zhuǎn)化的植株葉片小而黃，很易區(qū)分開。同時按照文獻5的方法檢測GUS活性,以檢驗轉(zhuǎn)基因的表達情況。抽真空法的轉(zhuǎn)化率極高，以供試植株為單位計算的轉(zhuǎn)化率達100%。另外，此法操作簡便，很適宜于為學生開設轉(zhuǎn)化實驗。其不足之處是，迄今此法只適用于對擬南芥的轉(zhuǎn)化。收藏到:[新浪ViVi][365Key][YouNote

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