GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥的培養(yǎng)及熒光觀察.docx

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1、GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥的培養(yǎng)及熒光觀察實(shí)驗(yàn)原理：1.GFP報(bào)告基因全稱為綠色熒光蛋白（Greenfluorescentprotein，GFP），簡稱GFP，20世紀(jì)60年代在水母中發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白。由238氨基酸組成的單鏈多肽，在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，用于蛋白質(zhì)在活細(xì)胞中的準(zhǔn)確定位及動(dòng)態(tài)變化觀察（分泌蛋白的分選、亞細(xì)胞定位）2.目的基因MAP65-1，是一種微管結(jié)合蛋白，可以根據(jù)擬南芥葉片表皮細(xì)胞、保衛(wèi)細(xì)胞，下胚軸和根部細(xì)胞中微管骨架的分布情況來推斷目的基因是否存在。3.表達(dá)載體：n植物表達(dá)載體的構(gòu)建→導(dǎo)入農(nóng)桿菌自我復(fù)制→浸染花粉

2、轉(zhuǎn)入擬南芥；n卡那霉素抗性培養(yǎng)基篩選，n卡那霉素:抗生素影響植物細(xì)胞葉綠體和線粒體的蛋白合成,引起植株黃化死亡.n卡那霉素能對(duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選實(shí)質(zhì)上是通過卡那霉素抗性基因起作用的。轉(zhuǎn)基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素,轉(zhuǎn)化體就很容易從非轉(zhuǎn)化體中篩選出來。GFP轉(zhuǎn)基因植株野生型植株GFP轉(zhuǎn)基因植株轉(zhuǎn)基因植株1/2MS培養(yǎng)基1/2MS卡那抗性培養(yǎng)基實(shí)驗(yàn)材料：GFP轉(zhuǎn)基因擬南芥種子及野生型種子；1/2MS培養(yǎng)基；1/2MS卡那抗性培養(yǎng)基；75％乙醇；10％NaClO；無菌水。實(shí)驗(yàn)步驟：1.種子春化（加

3、蒸餾水放入4℃冰箱中過夜）；2.75％乙醇消毒1min（混勻，盡量將液體吸凈，動(dòng)作要快）；3.10％NaClO消毒10min（混勻，盡量將液體吸凈，動(dòng)作要快）；4.無菌水洗三遍，用牙簽將種子點(diǎn)在培養(yǎng)基表面（每皿4-5顆種子盡量均勻）；5.封膜，做好標(biāo)記，平放于培養(yǎng)架上培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果：熒光顯微鏡下觀察記錄實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象，填表并解釋原因?野生型GFP-tubulin轉(zhuǎn)基因解釋實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象根部(或莖-下胚軸)?黃化苗正常?下胚軸：卡那抗性培養(yǎng)基上轉(zhuǎn)基因擬南芥下胚軸的葉綠體從數(shù)量和大小上都好于黃化苗，下胚軸的微管都呈現(xiàn)綠色。根：二者均無葉綠體，但轉(zhuǎn)基因

4、擬南芥根部微管呈現(xiàn)綠色。葉片?正常黃化苗?在葉肉細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞中，轉(zhuǎn)基因擬南芥觀察到綠色熒光標(biāo)記，但在野生型中未觀測(cè)到該現(xiàn)象。結(jié)果分析：野生型在卡那抗性培養(yǎng)基與轉(zhuǎn)基因相比出現(xiàn)黃化，短小，葉綠體小，少等長勢(shì)不優(yōu)良的現(xiàn)象，是因?yàn)橐吧筒淮嬖诳强剐曰?，而轉(zhuǎn)基因植株存在卡那抗性基因，所以可以將轉(zhuǎn)基因植株在卡那抗性培養(yǎng)基中篩選出來；在轉(zhuǎn)基因擬南芥中，熒光標(biāo)記在不同位置亮度效果不同，我們認(rèn)為可能是與不同位置微管分布情況和微管結(jié)合蛋白對(duì)不同位置的結(jié)合效果不同有關(guān)。注意事項(xiàng)：嚴(yán)格無菌操作.消毒過程動(dòng)作要快.槍頭不要重復(fù)使用，物品不要拿出超凈臺(tái).點(diǎn)

5、種時(shí)每個(gè)位置盡量只點(diǎn)一顆子.操作時(shí)盡量避免說話和人員走動(dòng).注意小組內(nèi)的配合和小組間的協(xié)調(diào).思考題：1.本實(shí)驗(yàn)用的了兩種培養(yǎng)基，有何不同？主要作用是什么？實(shí)驗(yàn)中分別用到了1/2MS培養(yǎng)基和1/2MS卡那抗性培養(yǎng)基。MS培養(yǎng)基是一種常用的植物組織培養(yǎng)基；在1/2MS培養(yǎng)基中無機(jī)鹽為MS培養(yǎng)基的一半。但在1/2MS卡那抗性培養(yǎng)基中添加了一種抗生素—卡那霉素?？敲顾啬軐?duì)轉(zhuǎn)基因植物進(jìn)行篩選實(shí)質(zhì)上是通過卡那霉素抗性基因起作用的。轉(zhuǎn)基因植物由于含有卡那霉素抗性基因而抑制了卡那霉素的作用，所以通過卡那霉素,轉(zhuǎn)化體就很容易從非轉(zhuǎn)化體中篩選出來。2.什

6、么是GFP?在生物學(xué)研究中有何用途？GFP是綠色熒光蛋白（Greenfluorescentprotein，GFP），簡稱GFP，20世紀(jì)60年代在水母中發(fā)現(xiàn)的發(fā)光蛋白。由238氨基酸組成的單鏈多肽，在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光，可以起到標(biāo)記目的基因的作用。3.GFP主要使用什么顏色的激發(fā)光？你觀察到得熒光是什么顏色？GFP在藍(lán)光或紫外光激發(fā)下發(fā)出綠色熒光