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《細胞的破碎與分離包涵體.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、細胞的破碎與分離概述很多生化產(chǎn)物存在于細胞內(胞內產(chǎn)物)細胞破碎技術是分離純化細胞內合成的非分泌型成分的基礎。胞內物分離概述藥物名稱宿主用途胰島素大腸桿菌治療糖尿病人生長激素（HGH）大腸桿菌治療侏儒病α--干擾素大腸桿菌治療毛狀細胞白血病和卡波濟肉瘤細菌細胞壁結構back酵母細胞壁結構一、細胞壁的組成和結構微生物革蘭氏陽性細菌革蘭氏陰性細菌酵母菌霉菌壁厚/nm20-8010-13100-300100-250層次單層多層多層多層主要組成肽聚糖（40-90%）多糖胞壁酸蛋白質脂多糖（1-4%）肽聚糖（5-10%）脂蛋白脂多糖（11-22%）磷脂蛋白質葡聚糖（30-40%）甘露聚糖（30%）蛋
2、白質（6-8%）脂類（8.5-13.5%）多聚糖（80-90%）脂類蛋白質細胞破碎機理圖細胞破碎細菌破碎的主要阻力來自于肽聚糖的網(wǎng)狀結構，網(wǎng)狀結構越致密，破碎的難度越大，革蘭氏陰性細菌網(wǎng)狀結構不及革蘭氏陽性細菌的堅固；酵母細胞壁破碎的阻力也主要決定于壁結構交聯(lián)的緊密程度和它的厚度；由于霉菌細胞壁中含有幾丁質或纖維素的纖維狀結構，其強度比細菌和酵母菌的細胞壁有所提高。細胞破碎細胞破碎1.珠磨法（Beadmill）細胞破碎高壓勻漿器細胞破碎細胞破碎超聲破碎法（Ultrasonication在15-25kHz的頻率下操作。其原理可能與空化現(xiàn)象（cavitationphenomena）引起的沖擊波
3、和剪切作用有關?？昭ㄅ萦捎谑艿匠暡ǖ难杆贈_擊而閉合，從而產(chǎn)生一個極為強烈的沖擊波壓力，由它引起的粘滯性旋渦在介質中的懸浮細胞上造成了剪切應力，促使細胞液體發(fā)生流動，從而使細胞破碎。20Hz20000Hz正常人耳能聽到的聲音的頻率范圍超聲次聲細胞破碎撞擊破碎化學破碎方法酸堿法表面活性劑有機溶劑化學破碎方法通用性差；時間長，效率低，一般胞內物質釋放率不超過50%；有些化學試劑有毒?；瘜W滲透法優(yōu)點：缺點：對產(chǎn)物釋放有一定的選擇性，可使一些較小分子量的溶質如多肽和小分子的酶蛋白透過，而核酸等大分子量的物質仍滯留在胞內；細胞外形完整，碎片少，漿液粘度低，易于固液分離和進一步提取。物理破碎方法滲透壓
4、沖擊凍融法細胞破碎后，大量帶電荷的內含物被釋放到水相，使導電率上升。1.破碎率的測定直接測定法目的產(chǎn)物測定法導電率測定法采用染色的方法把破碎的細胞與未破碎的細胞區(qū)別開來。將破碎后的細胞懸浮液離心分離細胞碎片，測定上清液中目的產(chǎn)物（如蛋白質或酶）的含量或活性，并與100%破碎率所獲得的標準數(shù)值比較，計算其破碎率。破碎率的測定破碎率的測定0.05%美藍染色結果基因工程包涵體的純化基因工程菌培養(yǎng)液不同表達形式的前處理胞外分泌型表達：離心,收集液相→濃縮→純化。胞內表達：胞內可溶性表達：離心,收集菌體→細胞破碎→離心，收集上清→純化胞內周質表達：離心,收集菌體→低濃度溶菌酶或滲透壓沖擊等溶解目標物
5、→離心,收集上清液→純化。不溶性包涵體：離心,收集菌體→細胞破碎→離心,收集沉淀→包涵體洗滌→目標蛋白變性溶解→復性→純化。包涵體的分離和蛋白質復性包涵體：指細菌表達的蛋白在細胞內凝集，形成無活性的固體顆粒。形成原因：表達量過高、過快外源蛋白在大腸桿菌中的積累蛋白產(chǎn)物占菌體總蛋白/%外源蛋白的積累人胰島素50%形成包涵體β-丙酰胺酶20%在細胞間區(qū)γ-人體干擾素25%形成包涵體凝乳酶原形成包涵體牛生長激素>30%形成包涵體β-內酰胺酶形成間區(qū)包涵體人胰島素原5%~26%形成包涵體包涵體表達形式的優(yōu)點在一定程度上保持表達產(chǎn)物的結構穩(wěn)定;能避免細胞內蛋白水解酶的作用，有利于目標蛋白的富集;簡化
6、外源基因表達產(chǎn)物的分離操作;能夠表達對大腸桿菌宿主有毒或有致死效應的目標蛋白包涵體表達形式的缺點以包涵體形式表達的重組蛋白喪失了原有的生物活性，必須通過有效的變性復性操作，才能回收得到具有正確空間構象（因而具有生物活性）的目標蛋白。體外復性蛋白質的成功率相當?shù)?，一般不超過30%復性處理工藝可使目標蛋白的制備成本上升。包涵體的純化方法收集菌體細胞細胞破碎包涵體的洗滌目標蛋白的變性溶解目標蛋白的復性包涵體獲得 幾種常見的工藝路線(一)機械破碎(高壓勻漿、高速珠磨）離心提取包含體加變性劑溶解除變性劑復性包涵體獲得 幾種常見的工藝路線（二）機械破碎膜分離獲得包涵體加變性劑溶解包含體除變性劑復性1）
7、包涵體的洗滌細胞破碎后，包含體呈顆粒狀，致密。洗滌的重要性：收集的沉淀中，除包涵體外，還包括許多雜質，如膜蛋白、肽聚糖、脂多糖等，復性時會與目標蛋白一起復性形成雜交分子而聚集，給后步純化帶來困難。洗滌劑：溫和的表面活性劑、蔗糖、低濃度的弱變性劑（如尿素）或脫氧膽酸等。能溶解除去部分膜蛋白和脂質類雜質。洗滌劑濃度以溶解雜質，不溶解包涵體中表達產(chǎn)物為原則。包涵體的溶解包涵體的分離和蛋白質復性二硫鍵目的次級鍵變性劑去污劑還原劑
