資源描述：
《實驗一蛋白質(zhì)的定量測定.doc》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、實驗一蛋白質(zhì)的定量測定——Folin—酚法一、目的要求（1）學習Folin—酚法測定蛋白質(zhì)含量的原理和方法；（2）制備標準曲線，測定未知樣品中蛋白質(zhì)含量。二、實驗原理?目前蛋白質(zhì)含量測定有兩類方法，一類是利用蛋白質(zhì)的物理化學性質(zhì)，如折射率，比重，紫外吸收等測定得知；另一類是利用化學方法測定蛋白質(zhì)含量，如微量克氏定氮，雙縮脲反應(yīng)，F(xiàn)olin—酚試劑法（Lowry法）。這兩類方法各有優(yōu)缺點，選用何種方法測定蛋白質(zhì)含量，可根據(jù)實驗要求和實驗條件進行選擇。目前實驗室多用Folin—酚法測定蛋白質(zhì)含量。此法的優(yōu)點是：操作簡單，迅速，不需特殊儀器設(shè)備，靈敏度高，較紫
2、外吸收法靈敏10—20倍，較雙縮脲法靈敏100倍，反應(yīng)約在15min內(nèi)有最大顯色，并至少可以穩(wěn)定幾個小時。其不足之處就是此反應(yīng)受多種因素干擾。在測定時應(yīng)排除干擾因素或做空白試驗消除。此法是在Folin—酚法的基礎(chǔ)上引入雙縮脲試劑，因此凡干擾雙縮脲反應(yīng)的基團，如-CO-NH2,-CH2-NH2,-CS-NH2以及在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖劑，如Tris緩沖劑以及蔗糖，硫酸銨，巰基化合物均可干擾Folin—酚反應(yīng)。此外，所測的蛋白質(zhì)樣品中，若含有酚類及檸檬酸，均對此反應(yīng)有干擾作用。而濃度較低的尿素（約0.5%左右），胍（0.5%左右），硫酸鈉（1%），硝酸鈉
3、（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）對顯色無影響，這些物質(zhì)在所測樣品中含量較高時，則需做校正曲線。若所測的樣品中含硫酸銨，則需增加碳酸鈉—氫氧化鈉濃度即可顯色測定。若樣品酸度較高，也需提高碳酸鈉—氫氧化鈉濃度1—2倍，這樣即可糾正顯色后色淺的弊病。Folin—酚試劑由甲試劑和乙試劑組成。甲試劑由碳酸鈉，氫氧化鈉，硫酸銅及酒石酸鉀鈉組成。蛋白質(zhì)中的肽鍵在堿性條件下，與酒石酸鉀鈉銅鹽溶液起作用，生成紫紅色絡(luò)合物。乙試劑是由磷鉬酸和磷鎢酸，硫酸，溴等組成。此試劑在堿性條件下，易被蛋白質(zhì)中酪氨酸的酚基還原呈藍色反應(yīng)，其色澤
4、深淺與蛋白質(zhì)含量成正比。此法也適用于測定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可測定范圍是25—250ug蛋白質(zhì)。雙縮脲法的原理雙縮脲(NH2-CO-NH-CO-NH2)在堿性溶液中可與銅離子產(chǎn)生紫紅色的絡(luò)合物，這一反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)。因為蛋白質(zhì)中有多個肽鍵，也能與銅離子發(fā)生雙縮脲反應(yīng)，且顏色深淺與蛋白質(zhì)的含量的關(guān)系在一定范圍內(nèi)符合比爾定律，而與蛋白質(zhì)的氨基酸組成及分子量無關(guān)，所以可用雙縮脲法測定蛋白質(zhì)的含量。雙縮脲反應(yīng)主要涉及肽鍵，因此受蛋白質(zhì)特異性影響較小。且使用試劑價廉易得，操作簡便，可測定的范圍為1～10mg蛋白質(zhì)，適于精度要求不太高的蛋白質(zhì)含量的測定，能測
5、出的蛋白質(zhì)含量須在約0.5mg以上。雙縮脲法的缺點是靈敏度差、所需樣品量大。干擾此測定的物質(zhì)包括在性質(zhì)上是氨基酸或肽的緩沖液，如TrIs緩沖液，因為它們產(chǎn)生陽性呈色反應(yīng)，銅離子也容易被還原，有時出現(xiàn)紅色沉淀。三、試劑和器材（一）試劑Folin—酚試劑:試劑甲：1)4%碳酸鈉溶液2)0.2mol/L氫氧化鈉溶液3)1%硫酸銅溶液4)2%酒石酸鉀鈉溶液。臨用前將（1）與（2）等體積配制碳酸鈉—氫氧化鈉溶液。（3）與（4）等體積配制成硫酸銅—酒石酸鉀鈉溶液。然后這兩種試劑按50:1的比例配合，即成Folin—酚試劑甲。此試劑臨用前配制，一天內(nèi)有效。試劑乙：稱鎢
6、酸鈉（Na2WO2?2H2O）100g，鉬酸鈉（Na2MoO4?2H2O）25g置2000ml磨口回流裝置內(nèi)，加蒸餾水700ml，85%磷酸50ml和濃硫酸100ml。充分混勻，使其溶解。小火加熱，回流10h（燒瓶內(nèi)加小玻璃珠數(shù)顆，以防溶液溢出），再加入硫酸鋰（LiSO4）150g，蒸餾水50ml及液溴數(shù)滴。在通風櫥中開口煮沸15min，以除去多余的溴。冷卻后定容至1000ml，過濾即成Folin—酚試劑乙貯存液，此液應(yīng)為鮮黃色，不帶任何綠色。置棕色瓶中，可在冰箱長期保存。若此貯存液使用過久，顏色由黃變綠，可加幾滴液溴，煮沸幾分鐘，恢復(fù)原色仍可繼續(xù)使用。
7、試劑乙貯存液在使用前應(yīng)確定其酸度。以之滴定標準氫氧化鈉溶液（1mol/L左右），以酚酞為指示劑，當溶液顏色由紅→紫紅→紫灰→墨綠時即為滴定終點。該試劑的酸度應(yīng)為2mol/L左右，將之稀釋至相當于1mol/L酸度應(yīng)用。（二）標準和待測蛋白質(zhì)溶液1.標準蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶牛血清白蛋白或酪蛋白，預(yù)先經(jīng)微量凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量，根據(jù)其純度配制成150ug/ml蛋白溶液2.待測蛋白質(zhì)溶液人血清，使用前稀釋100倍。（三）器材試管及試管架；0.5,1,及5ml移液管，恒溫水浴，分光光度計。四、操作方法（一）制作標準曲線取14支試管，分兩組按下表平行操作：試管編號試劑
8、處理1234567標準蛋白質(zhì)溶液/ml00.10.20.40.60.81.0蒸餾
