如何區(qū)分凋亡細(xì)胞與壞死細(xì)胞

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1、細(xì)胞凋亡(Apoptosis)?是生物界廣泛存在的一種現(xiàn)象,與其它的生命現(xiàn)象一樣具有同等重要的生理學(xué)或病理學(xué)意義。盡管其最終結(jié)果也是導(dǎo)致細(xì)胞死亡,但其誘導(dǎo)因素、發(fā)生機(jī)制和過(guò)程及意義均明顯不同于一般的病理性細(xì)胞死亡(即細(xì)胞壞死性死亡,簡(jiǎn)稱細(xì)胞死亡)?。?細(xì)胞凋亡的形態(tài)特征與細(xì)胞壞死性死亡的形態(tài)特征不同。細(xì)胞壞死性死亡是被動(dòng)的病理性死亡,其形態(tài)特征首先是膜通透性增加,細(xì)胞外型發(fā)生不規(guī)則變化,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張,核染色質(zhì)不規(guī)則移位,進(jìn)而線粒體及核腫張,溶酶體破壞,細(xì)胞膜破裂,胞漿外溢,這種死亡?過(guò)程常常引起炎癥反應(yīng)。細(xì)胞凋亡則是在某些因素的誘導(dǎo)下,由細(xì)胞內(nèi)在的有規(guī)律的機(jī)

2、制引起的,是主動(dòng)的生理性細(xì)胞自殺。其特征是細(xì)胞首先變圓,隨即與鄰近細(xì)胞脫離,失去微絨毛,胞漿濃縮,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張呈泡狀并與細(xì)胞膜融合,線粒體無(wú)明顯變化,核染色質(zhì)濃縮成塊并凝聚在核膜周邊,胞膜內(nèi)陷將細(xì)胞自行分割為多個(gè)有外膜包裹、內(nèi)涵物不外溢的凋亡小體,后被吞噬細(xì)胞或鄰周細(xì)胞所識(shí)別、吞噬。由于細(xì)胞凋亡過(guò)程不導(dǎo)致溶酶體破壞及胞膜破裂,沒(méi)有細(xì)胞內(nèi)容物外泄,故不引起炎癥反應(yīng),在生理?xiàng)l件下,生物體內(nèi)細(xì)胞存活與死亡是由自身發(fā)育階段提供的遺傳信息,或由鄰近細(xì)胞和其微環(huán)境提供的信號(hào)決定的,其中包括細(xì)胞相互接觸提供的信號(hào)以及周圍環(huán)境中活性物質(zhì)、激素等。?這些刺激信號(hào)的增加或減少調(diào)

3、節(jié)著細(xì)胞產(chǎn)生和凋亡,維系著機(jī)體細(xì)胞的有序狀態(tài)細(xì)胞凋亡的檢測(cè)細(xì)胞凋亡與壞死是兩種完全不同的細(xì)胞凋亡形式，根據(jù)死亡細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、生物化學(xué)和分子生物學(xué)上的差別，可以將二者區(qū)別開(kāi)來(lái)。細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多，下面介紹幾種常用的測(cè)定方法。一、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)檢測(cè)根據(jù)凋亡細(xì)胞固有的形態(tài)特征，人細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)檢測(cè)方法。細(xì)胞凋亡(apoptosis)的命名主要是根據(jù)某些單個(gè)細(xì)胞死亡時(shí)細(xì)胞碎裂如花瓣或樹(shù)葉散落般的形態(tài)學(xué)特征。目前對(duì)細(xì)胞凋亡的認(rèn)識(shí)不斷得到深化，檢測(cè)凋亡細(xì)胞的方法也逐漸增多，但形態(tài)改變?nèi)允谴_定細(xì)胞凋亡的最可靠的方法。光學(xué)顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的主要特征為核染色質(zhì)致密

4、深染，形成致密質(zhì)塊，有時(shí)可碎裂。在HE染色的組織切片中細(xì)胞積縮小.胞質(zhì)致密、嗜酸性染色增強(qiáng)，并可形成凋亡小體。在組織中凋亡細(xì)胞以分散單個(gè)形式存在，凋亡細(xì)胞與周圍細(xì)胞分離，不引起炎癥反應(yīng)。檢測(cè)方法：細(xì)胞涂片或組織石蠟切片作HE染色或Giemsa染色，在高倍物鏡下觀察凋亡細(xì)胞的形態(tài)改變，結(jié)合顯微鏡測(cè)量工具可作凋亡計(jì)數(shù)。本方法簡(jiǎn)便易行，但在細(xì)胞密集的組織中對(duì)于改變不典型的細(xì)胞判斷較困難，常缺乏較為特征的指標(biāo)，具有較強(qiáng)的主觀性，重復(fù)性差。本方法.可用于凋亡現(xiàn)象的初步觀察，作為分析指標(biāo)之一。視頻時(shí)差顯微技術(shù)（videotime-lapsemicroscopy）本方法

5、用于細(xì)胞培養(yǎng)，通過(guò)相差顯微鏡可動(dòng)態(tài)觀察細(xì)胞凋亡的變化過(guò)程，尤其是觀察細(xì)胞表和外形的變化。凋胞與基質(zhì)分離，胞體變圓、收縮、出泡，有的細(xì)胞拉長(zhǎng)，出現(xiàn)釘狀突起，持續(xù)數(shù)小時(shí)后細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞溶解，通過(guò)連續(xù)觀察，本方法可檢測(cè)培養(yǎng)基中凋亡細(xì)胞，但不能用于病理組織。檢測(cè)方法：收集2x105細(xì)胞/ml培養(yǎng)，置于多空培養(yǎng)板，加入凋亡誘導(dǎo)劑，在帶有自動(dòng)攝像裝置的相差顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞的動(dòng)態(tài)改變，每隔30秒作序列攝影，連續(xù)24小時(shí)。如同時(shí)進(jìn)行熒光染色，可參熒光顯微鏡下觀察和攝影。電子顯微鏡觀察凋亡細(xì)胞的典型形態(tài)改變?nèi)绨|(zhì)的固縮，染色質(zhì)濃縮成半月板或帽狀附于核膜，核的碎裂和凋亡

6、小體形成等，在透射電鏡下得到最佳體現(xiàn)。為凋亡細(xì)胞判定提供了最可靠的依據(jù)。本方法的缺點(diǎn)是樣品制作過(guò)程較復(fù)雜，且儀器、設(shè)備的費(fèi)用昂貴，較難廣泛大量開(kāi)展。由于樣品范圍局限，在凋亡數(shù)較少時(shí)需進(jìn)行大量的觀察才能觀察到典型的凋亡改變。檢查方法：透射電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，丙酮脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，超薄切片，醋酸枸櫞酸電子重染色，透射電鏡觀察。掃描電鏡標(biāo)本經(jīng)戊二醛和餓酸雙重固定，乙醇逐級(jí)脫水，CO2臨界點(diǎn)干燥，真空噴金，掃描電鏡觀察。一、檢測(cè)細(xì)胞膜成分變化的AnnexinV聯(lián)合PI法磷脂酰絲氨酸外翻分析（AnnexinV法）原理：磷脂酰絲氨酸（Phosphatid

7、ylserine,PS）正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)，但在細(xì)胞凋亡的早期，PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細(xì)胞膜的表面，暴露在細(xì)胞外環(huán)境中(圖3)。Annexin-V是一種分子量為35~36KD的Ca2+依賴性磷脂結(jié)合蛋白，能與PS高親和力特異性結(jié)合。將Annexin-V進(jìn)行熒光素（FITC、PE）或biotin標(biāo)記，以標(biāo)記了的Annexin-V作為熒光探針，利用流式細(xì)胞儀或熒光顯微鏡可檢測(cè)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。碘化丙啶(propidineiodide,PI)是一種核酸染料，它不能透過(guò)完整的細(xì)胞膜，但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞，PI能夠透過(guò)細(xì)胞膜而使細(xì)胞核紅染。因此將Anne

8、xin-V與PI匹配使用，就可以將凋亡早晚期的細(xì)胞以及死細(xì)胞區(qū)分開(kāi)