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《蛋白質(zhì)的通性、純化與表征》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、第03章蛋白質(zhì)的性質(zhì)和分離純化PropertiesandPurificationofProtein生物化學(xué)Biochemistry生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院陳吉寶蛋白質(zhì)是一種兩性電解質(zhì)1、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)pH=6蛋白質(zhì)份子表面分布著不同的電荷。蛋白質(zhì)等電點(diǎn)：使某特定蛋白質(zhì)分子上所帶正負(fù)電荷相等時(shí)溶液的pH值為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)（pI）。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)和它所含的酸性氨基酸殘基和堿性氨基酸殘基的比例有關(guān)。蛋白質(zhì)溶液處于等電點(diǎn)時(shí)，溶解度最小。由于①蛋白質(zhì)表面極性基團(tuán)形成的水化膜，②非等電狀態(tài)時(shí)，同種電荷的互相排斥，③質(zhì)點(diǎn)大小在1-100nm，故蛋白質(zhì)水溶液是膠體溶液。穩(wěn)定蛋白質(zhì)膠體
2、溶液的主要因素 ①水化層(hydrationshell);②靜電排斥：2、蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與沉淀一旦電荷被中和或水化膜被破壞，在蛋白質(zhì)的疏水作用下，蛋白質(zhì)顆粒聚集，便從溶液中析出沉淀。蛋白質(zhì)沉淀(precipitation)的方法③重金屬鹽沉淀法：pH大于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，可與重金屬離子結(jié)成不溶性沉淀（Ca2+、Mg2＋、Ba2+、Pb2+與羧基結(jié)合；Mn2＋、Zn2＋、Fe2+、Cu2+、Co2+、Ni2+與羧基、含氮化合物及雜環(huán)化合物結(jié)合；Ag+、Hg2+、Pb2+能與巰基結(jié)合）。重金屬沉淀的蛋白質(zhì)常是變性的。②有機(jī)溶劑沉淀法：與蛋白質(zhì)份子爭(zhēng)奪水分子，
3、破壞蛋白質(zhì)表面的水化膜，降低介電常數(shù)。使用較多的有機(jī)溶劑是乙醇、甲醇等。在常溫下，有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)往往引起變性。例如酒精消毒滅菌就是如此。①鹽析法：向蛋白質(zhì)溶液中加入大量的中性鹽[(NH4)2SO4、Na2SO4、NaCl]，使蛋白質(zhì)脫去水化層而聚集沉淀。蛋白質(zhì)不變性。④生物堿試劑和某些酸類沉淀法：pH小于等電點(diǎn)時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷，易與生物堿試劑和酸類的負(fù)離子生成不溶性沉淀。生物堿試劑：是指能引起生物堿沉淀的一類試劑，單寧酸、苦味酸、鎢酸。酸類：三氯乙酸、磺基水楊酸。⑤加熱變性沉淀：將接近于等電點(diǎn)附近的蛋白質(zhì)溶液加熱，熱穩(wěn)定性差的蛋白質(zhì)將發(fā)生變性而凝固沉淀。3、
4、蛋白質(zhì)的分離純化蛋白質(zhì)分離純化的總目標(biāo)：增加制品的純度或比活性（單位蛋白質(zhì)重量中目標(biāo)蛋白質(zhì)的含量或生物活性）。3.1.1前處理(pretreatment)——釋放蛋白質(zhì)①將組織和細(xì)胞破碎動(dòng)物組織和細(xì)胞：電動(dòng)搗碎機(jī)、勻漿器、超聲波處理植物組織和細(xì)胞：石英砂+提取液、研磨、纖維素酶處理細(xì)菌：超聲波震蕩、與砂研磨、高壓擠壓、溶菌酶處理②收集細(xì)胞的某一組分：差速離心法③如果提取膜蛋白：超聲波或去污劑使膜解聚，然后用適當(dāng)?shù)慕橘|(zhì)提取。3.1一般程序：前處理、粗分級(jí)、細(xì)分級(jí)、濃縮與保存3.1.2粗分級(jí)(roughfractionation)——去雜質(zhì)蛋白質(zhì)和其它大分子一般用選擇
5、性沉淀法：①鹽析（例如用(NH4)2SO4分級(jí)沉淀）；②等電點(diǎn)選擇性沉淀法；③有機(jī)溶劑分級(jí)沉淀法；④熱處理選擇性沉淀法；⑤生物堿或三氯乙酸選擇性沉淀法3.1.3細(xì)分級(jí)（finefractionation)——純化①透析除鹽；②凝膠過(guò)濾除鹽；③層析法：凝膠過(guò)濾層析、離子交換層析、吸附層析、親和層析、疏水層析（反相HPLC）；④電泳法；⑤密度梯度離心。3.1.4濃縮與保存結(jié)晶方法：使溶液略處于過(guò)飽和狀態(tài)。降低溫度、鹽析、加有機(jī)溶劑、調(diào)節(jié)pH等。凍干粉保存：在冷凍狀態(tài)下讓樣品中的液體升華。溶液保存：加入抗凍劑（50%甘油）后-20~-70℃保存。蛋白質(zhì)分子的大?。和肝?、
6、超濾、密度梯度離心、凝膠過(guò)濾蛋白質(zhì)溶解度：鹽析、有機(jī)溶劑沉淀法、等電點(diǎn)沉淀蛋白質(zhì)電荷狀況：凝膠電泳、等電聚焦、離子交換層析蛋白質(zhì)吸附性質(zhì)：羥基磷灰石吸附層析、疏水作用層析蛋白質(zhì)生物學(xué)親和性：親和層析3.2常見(jiàn)蛋白質(zhì)分離純化的方法與原理透析：半透膜阻留pro分子，而讓小的溶質(zhì)分子（無(wú)機(jī)鹽）和水通過(guò)，以達(dá)到除去蛋白質(zhì)溶液中小分子（鹽、低分子酸，單糖等）。超濾：施以一定的壓力使小分子溶質(zhì)通過(guò)一半透膜，而按半透膜的篩孔大小截留相應(yīng)的蛋白質(zhì)分子。1）透析和超濾2）凝膠過(guò)濾層析（GFC）Vt-Vo或Vi+VmVtVo分離介質(zhì):凝膠顆粒（交聯(lián)葡聚糖、聚丙烯酰胺、瓊脂糖等），具有
7、不均勻的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)分離機(jī)制：分子篩效應(yīng)，即根據(jù)蛋白質(zhì)分子大小不同來(lái)分離蛋白質(zhì)，大分子物質(zhì)最先流出柱外，小分子物質(zhì)最后流出柱外。分配系數(shù)Kd可以把凝膠層析看成是液-液分配層析。固定相是凝膠珠內(nèi)部水相（Vi），流動(dòng)相是凝膠外部水相（Vo）。Kd為樣品在兩相間的分配系數(shù)，也可以說(shuō)Kd是分子量不同的溶質(zhì)在凝膠內(nèi)部水和外部水中的分配系數(shù)，它只與被分離物分子的大小和凝膠顆?？紫兜拇笮》植加嘘P(guān)，而與柱的粗細(xì)長(zhǎng)短無(wú)關(guān)，也就是說(shuō)它對(duì)特定物質(zhì)為常數(shù)，與柱的物理?xiàng)l件無(wú)關(guān)。Kd=(Ve-Vo)/Vi在限定的層析條件下，Vt和Vo都為恒定值，Ve值是隨著分離物分子質(zhì)量的變化而變化的。分離物分
8、子質(zhì)量大，
