第三章 蛋白質(zhì)的通性、純化和表征.ppt

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1、第3章蛋白質(zhì)的分離純化和表征一.蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)各個解離基團的pK值與游離氨基酸的不完全相同。短肽的等電點和凈電荷量可以根據(jù)pK值計算，蛋白質(zhì)的等電點要用等電聚焦等方法測定。二.蛋白質(zhì)分子的大小與形狀（一）根據(jù)化學(xué)組成測定最低相對分子質(zhì)量假定某種微量成分只有一個，測出其百分含量后，可用比例式算出最低相對分子質(zhì)量。若測出兩種微量成分的百分含量，分別用比例式算出的最低相對分子質(zhì)量不相同時，可計算兩個最低相對分子質(zhì)量近似的最小公倍數(shù)。例題：一種純酶含亮氨酸（Mr131）1.65%，含異亮氨酸（Mr131）2.48%，求最低相對分子質(zhì)量。解：按照Leu的百分含量計算，最低MrX1：X

2、1=(100?131)/1.65=7939.4按照Ile的百分含量計算最低MrX2：X2=(100?131)/2.48=5282.3由于X1和X2數(shù)字差異較大，提示這種酶含Leu和Ile不止1個，為了估算Leu和Ile的個數(shù)，首先計算：X1/X2=7939.4/5282.3≈1.5這種酶含任何氨基酸的個數(shù)均應(yīng)是整數(shù)，說明該酶至少含有2個Leu，3個Ile，其最低相對分子質(zhì)量為：7939.4?2=15878.8或5282.3×3=15846.9（二）滲透壓法測定相對分子質(zhì)量（三）沉降分析法測定相對分子質(zhì)量基本原理：⒈離心力（centrifugalforce，F(xiàn)c）：當(dāng)一個粒子（

3、生物大分子或細胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時，此離心力“Fc”由下式定義：F=m·a=m·ω2ra—粒子旋轉(zhuǎn)的加速度，m—沉降粒子的有效質(zhì)量，ω—粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，r—粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)。⒉相對離心力（relativecentrifugalforce，RCF）:由于各種離心機轉(zhuǎn)子的半徑或者離心管至旋轉(zhuǎn)軸中心的距離不同，離心力而受變化，因此在文獻中常用“相對離心力”或“數(shù)字×g”表示離心力，只要RCF值不變，一個樣品可以在不同的離心機上獲得相同的結(jié)果。RCF就是實際離心場轉(zhuǎn)化為重力加速度的倍數(shù)。X為離心轉(zhuǎn)子的半徑距離，以cm為單位；g為地球重力加速度（980cm/sec

4、2）；n為轉(zhuǎn)子每分鐘的轉(zhuǎn)數(shù)（revolutionsperminute,簡寫成r/min,或rpm）。22⒊沉降系數(shù)（sedimentationcoefficient，s）：1924年Svedberg對沉降系數(shù)下的定義為顆粒在單位離心力場中移動的速度。n若ω用2πn/60表示，則nX1：離心前粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離；X2：離心后粒子離旋轉(zhuǎn)軸的距離。S：沉降系數(shù)，時常在10-13秒左右，故把沉降系數(shù)10-13秒稱為一個Svedberg單位，簡寫S，量綱為秒。例如，動物原生質(zhì)核糖體的沉降系數(shù)等于80S，它的含義就是：80×10-13s。細胞及細胞的各組分的沉降系數(shù)有很大的差異，所以可以

5、利用生物樣品沉降系數(shù)的差異采用離心技術(shù)將他們彼此分開。⒋沉降速度（sedimentationvelocity）：對于球形顆粒Fc=1/6?d3(ρp?ρm)ω2XFf=3?dv當(dāng)Fc=Ff時1/6?d3(ρp?ρm)ω2X=3?ηdvv=(1/18η)[d2(ρp?ρm)ω2X]Fc：離心力；Ff：摩擦力：d：球形粒子直徑；η：流體介質(zhì)的粘度；ρP：粒子的密度；ρm：介質(zhì)的密度；v：粒子移動的速度從上式可知，粒子的沉降速度與粒子直徑的平方、粒子的密度和介質(zhì)密度之差成正比；離心力場增大，粒子的沉降速度也增加，將此式代入上項沉降系數(shù)公式中，則S也可表示為：①當(dāng)ρP＞ρm，則S＞0

6、，粒子順著離心方向沉降。②當(dāng)ρP＝ρm，則S＝0，粒子到達某一位置后達到平衡。③當(dāng)ρP＜ρm，則S＜0，粒子逆著離心方向上浮。2d5.沉降系數(shù)與物質(zhì)相對分子質(zhì)量:根據(jù)Svedberg公式，由沉降系數(shù)可以計算出物質(zhì)的相對分子質(zhì)量：Mr=RTS20,W/[D20,W(1-γρ)]Mr:相對分子質(zhì)量；D20,W：以20℃的水為介質(zhì)時顆粒的擴散系數(shù)；R:氣體常數(shù)；T：絕對溫度；S20,W：以20℃的水為介質(zhì)時顆粒的沉降系數(shù)；γ：偏比容，等于溶質(zhì)粒子密度的倒數(shù)；ρ：溶劑密度6.沉降時間（sedimentationtime，Ts）:在實際工作中，常常遇到要求在已有的離心機上把某一種溶質(zhì)從

7、溶液中全部沉降分離出來的問題，這就必須首先知道用多大轉(zhuǎn)速與多長時間可達到目的。如果轉(zhuǎn)速已知，則需解決沉降時間來確定分離某粒子所需的時間。根據(jù)沉降系數(shù)的定義可得積分得X2:離心轉(zhuǎn)軸至離心管底內(nèi)壁的距離；X1:離心轉(zhuǎn)軸至樣品溶液面之間的距離，那么（t2－t1）用Ts表示：7.K系數(shù)（kfactor）:K系數(shù)是用來描述在一個轉(zhuǎn)子中，將粒子沉降下來的效率。也就是使溶液澄清的一個指數(shù)，所以也叫“cleaningfactor”。原則上，K系數(shù)愈小將粒子沉降的速度愈快。由其公式可知，K系數(shù)與離心轉(zhuǎn)速及粒子沉降的路徑有