POD 測(cè)定方法

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1、植物體POD的測(cè)定※<原理>了解過(guò)氧化氫酶活性測(cè)定的幾種方法，掌握用愈創(chuàng)木酚法分別測(cè)定過(guò)氧化氫酶和過(guò)氧化物酶的活性。過(guò)氧化物酶廣泛頒布于植物的各個(gè)組織器官中。在有過(guò)氧化氫存在下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，可用分光光度計(jì)測(cè)量生成物的含量?！?實(shí)驗(yàn)材料、試劑與儀器設(shè)備>1、實(shí)驗(yàn)儀器　722型分光光度計(jì)、離心機(jī)、秒表、電子天平、研缽2、實(shí)驗(yàn)試劑　愈創(chuàng)木酚、30%過(guò)氧化氫、20mmol/LKH2PO4、100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)、反應(yīng)混合液［100mmol/L磷酸緩沖液(pH6.0)50m

2、L，加入愈創(chuàng)木酚28uL，加熱攪拌，直至愈創(chuàng)木酚溶解，待溶液冷卻后，加入30%過(guò)氧化氫19uL，混合均勻保存于冰箱中］3、實(shí)驗(yàn)材料　任何植物材料※<實(shí)驗(yàn)步驟>1、粗酶液的提取　稱(chēng)取植物(小麥葉片)材料0.1g，加20mmol/LKH2PO45mL，于研缽中研磨成勻漿，以10000r/min離心10分鐘，收集上清液保存在冷處，所得殘?jiān)儆?0mmol/LKH2PO45mL溶液提取一次，全并兩次上清液。2、酶活性的測(cè)定　取比色皿2只，于一只中加入反應(yīng)混合液3mL，KH2PO41mL，作為校零對(duì)照，另一只中加入反應(yīng)混合液

3、3mL，上述酶液1mL(如酶活性過(guò)高可適當(dāng)稀釋)，立即開(kāi)啟秒表，于分光光度計(jì)470nm波長(zhǎng)下測(cè)量OD值，每隔30s讀數(shù)一次。以每分鐘表示酶活性大小，即以△OD470/min.mg蛋白質(zhì)表示，蛋白質(zhì)含量測(cè)定按Folin法進(jìn)行?！?結(jié)果計(jì)算>以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以ΔA470/[min.g(鮮重)]表示之。也可以用每min內(nèi)A470變化0.01為1個(gè)過(guò)氧化物酶活性單位(u)表示。過(guò)氧化物酶活性[u/(g.min)]=式中：ΔA470——反應(yīng)時(shí)間內(nèi)吸光度的變化。W——植物鮮重，g。VT——提取酶液總體積，

4、mL。Vs——測(cè)定時(shí)取用酶液體積,mL。t——反應(yīng)時(shí)間，min。項(xiàng)目詳細(xì)信息介紹項(xiàng)目名稱(chēng)過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定（比色法）所屬實(shí)驗(yàn)課程植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)學(xué)年度2007-2008學(xué)期01專(zhuān)業(yè)分類(lèi)生物化學(xué)關(guān)鍵詞過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定實(shí)驗(yàn)要求選修帶課教師陳穎實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪^(guò)氧化物酶廣泛分布于植物的各個(gè)組織器官中。在有過(guò)氧化氫存在下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色物質(zhì)，可用分光度計(jì)測(cè)量生成物的含量?；久枋?．稱(chēng)取植物材料1g，加入，0.1mo1/L磷酸緩沖(pH7.0)10ml(分三次加入，最后兩次用于洗研缽

5、)，在研缽中研磨成勻漿，以4000r／min離心15分鐘，傾出上清液。2．取一試管加3.8ml0.3%愈創(chuàng)木酚反應(yīng)液，加100ul3％過(guò)氧化氫，加酶液100ul（視酶活性大小而定，如酶濃度高可稀釋后再測(cè)定），搖勻，立即在分光光度計(jì)470nm下測(cè)吸光度，從加入酶液時(shí)立即開(kāi)啟秒表記錄時(shí)間，1分鐘時(shí)讀數(shù)一次（也可2min，視材料而定）。3．以每分鐘吸光度變化值表示酶活性大小，即以△A470/min.mg蛋白質(zhì)（或鮮重g）表示之。過(guò)氧化物酶活性(U)=△A470/min×稀釋倍數(shù)/g.Fw該實(shí)驗(yàn)涉及到的主要儀器設(shè)備null

6、實(shí)驗(yàn)總?cè)藬?shù)30每組人數(shù)4實(shí)驗(yàn)學(xué)時(shí)2是否特色否實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)室3.POD的測(cè)定方法試劑配制：（1）0.1mol/L的醋酸緩沖液：8.8mlA+41.2mlB得到100mlph5.4的醋酸緩沖液A(0.2mmol/L的HAc溶液)—6ml冰醋酸溶到494ml蒸餾水中B(0.2mmol/L的NaAc溶液)—13.6gNaAc.3H2O（2）0.25%愈創(chuàng)木酚溶液—125um愈創(chuàng)木酚溶于50ml50%乙醇中（臨用前配制）（3）0.75%H2O2溶液：1.25ml30%H2O2定容至50ml（臨用前配制）方法：比色杯

7、中依次加入2ml0.1mol/L的醋酸緩沖液—1ml0.25%愈創(chuàng)木酚溶液—xml酶液（5min值為500-800即可）—0.1ml0.75%H2O2溶液—迅速巔到混勻把A460調(diào)零并開(kāi)始計(jì)時(shí)—1次/30s,連續(xù)讀取3min過(guò)氧化物酶(POD)活性的測(cè)定【實(shí)驗(yàn)原理】植物體內(nèi)的黃素氧化酶類(lèi)代謝產(chǎn)物常包含H202，如光呼吸中的乙醇酸氧化酶、呼吸作用中的葡萄糖氧化酶等。H202的積累可導(dǎo)致破壞性的氧化作用。過(guò)氧化氫酶(CAT)、過(guò)氧化物酶(POD)是清除H202的重要保護(hù)酶，能將H202分解為02和H20,從而使機(jī)體免受

8、H202的毒害作用。其活性與植物的抗逆性密切相關(guān)。(CAT)催化如下反應(yīng)：2H202→2H20+02本實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)定H202的減少量來(lái)測(cè)定CAT的活性。在H202存在條件下，過(guò)氧化物酶能使愈創(chuàng)木酚氧化，生成茶褐色的4-鄰甲氧基苯酚?？捎梅止夤舛扔?jì)測(cè)生成物的含量來(lái)測(cè)定活性?！驹噭┧幤?.50mmol/lpH7.0的磷酸緩沖液2.0.3%H202:吸0.5ml30